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专利名称:用于癌症诊断和治疗的组合物和方法
技术领域:
本发明涉及癌症的诊断,特别是通过检测miR15和miR16拷贝数目,突变情况,或基因表达来诊断慢性淋巴性白血病或前列腺癌。本发明还涉及癌症的治疗,包括miR15或miR16基因表达的减少或缺失,特别是通过施用miR15或miR16基因产物治疗慢性淋巴性白血病或前列腺癌。
背景技术:
在美国和全世界癌症都是死亡和发病的一个重要原因。特别是慢性淋巴性白血病(“CLL”)和前列腺癌在临床上是重要的***肿瘤病。CLL是西方世界是最普遍的一种***白血病形式。而且在美国的男人中,前列腺癌的年龄校正发病率目前超过了所有其它癌症,仅次于肺癌,是该国家所有男性癌症死亡的第二大原因。在多于一半的报道CLL病例中都会发生13ql4的半合子丢失和/或纯合子丢失,这构成了CLL中最频繁的染色体异常。CLL患者的组织样品的染色体组型相对具有较少的染色体异常,这表明所观察到的13ql4缺失的特异性和频率具有病理学重要性。除此之外,60%的前列腺癌中也具有13ql4缺失,表明CLL和前列腺癌的发病机理涉及位于13ql4的一种或多种肿瘤抑制基因。CLL和前列腺癌中同时存在克隆性纯合和杂合性缺失,以及非常高的13q4
丢失频率,表明该区域的缺失与特定癌症类型的病因有关。对几种基因进行位置克隆以鉴别缺失部位的基因。至今从突发性CLL和遗传性CLL的13ql4的缺失区域共鉴别了八个基因,并检测了其DNA和/或RNA水平的改变:Leul(BCMS或EST70/Leul),Leu2(ALT1或1B4/Leu2),Leu5(CAR),CLLD6,KPNA3,CLLD7,L0C51131(推测的锌指蛋白NY-REN-34抗原)和CLLD8。但是,详细的基因分析,包括大范围的杂合性丢失(LOH),突变和表达研究,却没能证明任何这些基因与致癌作用的关系。小分子RNA(miRNA)存在于超过一百种不同的生物体中,包括果蝇,线虫和人。认为在这些生物体中在多种发育调节过程中都涉及到miRNA,miRNA典型地是通过60到70个核苷酸的反馈RNA前体结构的处理得到的,该反馈RNA前体结构是由miRNA基因转录而来的。RNA前体或处理的miRNA产物很容易检测,缺少这些分子表明相应miRNA基因的缺失或功能丢失。目前CLL的治疗典型地包括化学疗法,单独施用或与自体同源骨髓移植一起进行。所使用的化学治疗剂通常对患者具有毒性,在大部分患者中都只是达到部分缓解的效果。前列腺癌和其它癌症治疗的疗法也包括化学疗法,通常是在外科手术切除肿瘤以后。但是,对于CLL,化学治疗剂(与外科手术一起进行或不与其一起进行)的治疗受到限制。前列腺癌也可以用外部射线照射或近距离放射疗法(例如使用具有放射活性的“种子”)治疗,也是单独使用或与外科手术一起使用。这种治疗的危险是将患者的正常组织暴露
在放射线之中,以及可能不是完全有效。CLL或前列腺癌需要有快速,经济和准确的诊断性检测。对于癌症还需要有经济和有效的并且对患者没有显著的负面影响的治疗,特别是CLL或前列腺癌。发明简述现已发现在人中,miR15或miR16基因位于13ql4,而在很大一部分CLL或前列腺癌患者中13ql4区域都缺失。还发现miR15或miR16基因的RNA产物抑制CLL和前列腺癌细胞的赘生物或肿瘤生长。这些RNA产物可以用于癌症治疗,对miR15或miR16基因进行负调控。miR15和miR16小分子RNA基因位于13ql4,在CLL和前列腺癌丢失的30kb区域中,在大部分CLL和前列腺癌中这两个基因都缺失或受到负调控。因此,本发明提供了一种CLL或前列腺癌的诊断性检测,包括检测这些基因的基因产物,检测miR15或miR16基因的拷贝数,或测定其突变情况。在一个实施方案中,所述诊断检测包括从怀疑患有CLL或前列腺癌的患者中分离RNA,用miR15或miR16前体或处理过的miRNA的探针用Northernblot杂交检测miR15或miR16基因产物,其中miR15或miR16前体或处理过的miRNA与正常样品对照相比有所减少则诊断为CLL或前列腺癌。在另一个实施方案中,所述诊断检测包括从怀疑患有miR15或miR16介导的癌症例如CLL或前列腺癌的患者中分离DNA,用miR15或miR16基因序列的探针用Southernblot
杂交检测miR15或miR16基因拷贝数,其中基因拷贝数减少到1或0则诊断为CLL或前列腺癌。在另一个实施方案中,所述诊断检测包括通过评价D13S273和D13S272标记的杂合性丢失检测miR15或miR16基因拷贝数的减少,其中有这些标记的杂合性丢失诊断为CLL或前列腺癌。在另一个实施方案中,所述诊断检测包括从怀疑患有CLL或前列腺癌的患者中分离DNA,用PCR扩增miR15或miR16基因片段检测miR15或miR16基因的缺失或突变并将该扩增片段与正常样品对照的扩增片段相比较,其中在miR15或miR16基因的一个或多个拷贝中检测到突变则诊断为CLL或前列腺癌。可以用单链构象多态性方法比较扩增片段。在一方面,所述突变为miR15或miR16基因序列的部分缺失。在另一个实施方案中,所述诊断检测包括从怀疑患有CLL或前列腺癌的患者中分离RNA,检测到miR15或miR16基因产物的突变则诊断为CLL或前列腺癌。在另一个实施方案中,所述诊断检测包括从怀疑患有CLL或前列腺癌的患者中分离RNA,用逆转录酶-聚合酶链式反应扩增miR15或miR16前体或处理过的miRNA从而检测miR15或miR16基因产物的水平,其中miR15或miR16前体或处理过的miRNA与内对照的扩增RNA相比有所减少则诊断为CLL或前列腺癌。本发明还提供了一种在需要治疗的患者中治疗miR15或miR16介导的癌症的方法,包括将有效量的miR15或miR16基因产物给予患者,由此癌细胞的增殖受到抑制。
本发明还提供了一种在需要治疗的患者中治疗miR15或miR16介导的癌症的方法,其中分离患者的细胞并在离体条件下用有效量的含有编码miR15或miR16基因产物的序列的核酸转染。然后将这些细胞重新植入到患者体内,由此患者的癌细胞的增殖受到抑制。本发明进一步提供了一种在患者中抑制miR15或miR16介导的癌症的增殖的方法,包括向细胞递送有效量的miR15或miR16基因产物。本发明进一步还提供了一种治疗患有miR15或miR16介导的癌症的患者的药物组合物,包括分离的miR15或miR16基因产物,或编码miR15或miR16基因产物的核酸,以及药学可接收的载体。附图简述图IA和图IB分别是预测的miR15和miR16前体RNA的二级结构的示意图。用“mfold”程序,,Matthewsetal.(1999),:911_940进行RNA二级结构预测,人工修饰以使螺旋区段内包含G/U摆动碱基对。处理的miR15和miR16miRNA以下划线表示。根据Lagos-Quintanaetal.(2001),Science294:853_858进行了修改。图2A是CLL中13ql4肿瘤抑制子位点内的基因图谱,显示出miR15/16基因簇的定位。其中显示了遗传标记和基因在图谱上的位置。图2B是已报道过的13ql4缺失图谱,用水平条框标记。图2C是D13S1150和D13S272标记之间的位点图谱。在此位点上每个基因的方向都在基因名称下方用箭头标出,彩色的垂直条表示每个基因相应外显子的位置。图
2D是Alu18和D13S272标记之间的位点图谱。条和框表示LEU2/ALT1和LEUl外显子的位置。短垂直箭头表示miR15或miR16基因的位置。圆点表示用于筛选衍生自两种独立的白血病细胞(CLL-A和CLL-B)的融合细胞的体细胞杂交克隆的PCR引物的位置。填充框表示杂交体中的染色体13的部分。“―”表示在来自患有具有t(2;13)(ql2;ql3)移位的CLL,两边眼癌,溃疡性结肠炎的患者的克隆CLL-。长垂直箭头表示具有t(2;13)(q32;ql4)移位的克隆CLL-B的断点位置,“一29kb―”表示该克隆中大约29kb的缺失区域。图3A是正常人肾,前列腺,肝脏,骨骼肌(“Sk肌”),睾丸,CD5+B细胞(CD5+),白血病细胞("PerBlLeuk")和骨髓(“BM”)中miR15和miR16基因表达的Northernblot分析。图3B是在18个CLL患者中微卫星标记D13S272和D13S273的杂合丢失(“L0H”)分析。用来自正常人⑶5+细胞的DNA作为对照。样品的LOH状态用“+/+杂合”,“+/-L0H”,“-/_纯合缺失”,“Ni,,(无意义),“?”(没有足够材料)和“ND”(未实施)。用溴化乙锭染色的Northern凝胶作为归一化对照。发明详述本文给出的所有核酸序列都是5’到3’方向的。此外,核酸序列中的所有脱氧核糖核苷酸都用大写字母表示(例如,脱氧胸腺嘧啶为“T”),核酸序列中的核糖核苷酸用小写字母表示
(例如尿嘧啶为“U”)。CLL或前列腺癌可以通过检测miR15或miR16基因拷贝数的减少,或者通过检测miR15或miR16基因的一个或多个拷贝的突变来诊断。miR15或miR16基因拷贝数从双倍减少为单倍,或者减少到没有拷贝,则诊断为CLL或前列腺癌。同样地,miR15或miR16基因的一个或多个拷贝的突变表示基因功能的丢失,则诊断为CLL或前列腺癌。这里所用的“CLL细胞”是来自患有或怀疑患有CLL的患者的淋巴细胞,其中淋巴细胞的“CLL分数”至少为4,这是根据Matutesetal.(1994),Leukemia8(10)1640-1645所述的评分系统确定的,在此引入其全文作为参考。这里所用的“前列腺癌细胞”是来源于的前列腺的赘生物或肿瘤细胞,不管其是否位于前列腺中。本领域技术人员可以容易地鉴别CLL或前列腺癌细胞。miR15/miR16基因簇的位置在13ql4。这些基因的核酸序列包含在克隆317gll中,其核苷酸序列的GenBank记录号是AC069475。在此引入该记录的全部内容作为参考。可以通过测定怀疑患有CLL或前列腺癌的患者组织中的这些基因的结构或序列,并将其与该患者的未受影响的组织样品中,或正常对照组织的样品中的这些基因的结构或序列进行比较,从而检测miR15或miR16基因的缺失或突变。可以用任何适当的方法进行这种比较。根据本发明,要诊断miR15或miR16介导的癌症,要从患者中获取组织样品。然后制备样品并测定miR15
或miR16基因产物的表达或miR15或miR16基因的缺失或突变。组织样品包括感兴趣的活组织,以及血液和体液样品。这里所说的“miR15或miR16介导的癌症”是指在至少一部分与该癌症相关的肿瘤细胞或赘生物细胞中miR15或miR16基因减少或缺失的任何癌症。miR15或miR16介导的癌症的实例包括CLL和前列腺癌。miR15或miR16缺失或突变的存在可以通过患者基因组DNA的Southernblot杂交来检测,使用miR15或miR16基因的探针,例如如下所述的。另外,可以从怀疑患有CLL或前列腺癌的患者中获取血液样品,分离白细胞进行DNA提取。优选血液或组织样品是从还没有开始放射疗法或化学疗法的患者中获得的。作为对照的相应的组织或血液样品可以从该患者的未受影响的组织中,或者从正常的人个体中获得。Southernblot杂交技术是本领域技术人员公知的。例如将从怀疑患有CLL或前列腺癌的患者的组织或血液中分离的基因组DNA用限制性内切酶消化。消化产生基因组DNA的限制性片段,可以用电泳,例如琼脂糖电泳分离。然后将限制性片段点样在杂交膜(例如***纤维素或尼龙)上,并与miR15或miR16基因特异的标记探针进行杂交。与该患者的DNA样品进行了相同处理的对照DNA样品相比,杂交膜上限制性片段类型的改变表示这些基因发生缺失或突变。本领域普通技术人员可以容易地确定适合于检测miR15或miR16基因拷贝数或突变的探针标记和杂交条件。这里所用的术语
“缺失”是指基因的部分缺失或全部基因缺失。用于Southernblot杂交的miR15和miR16核酸探针可以根据公开的miR15和miR16小分子RNA的序列用Lagos-Quintanaetal.(2001),Science294853-858所述的方法设计,在此引入其全文作为参考。miR15小分子RNA的核苷酸序列是uagcagcacauaaugguuugug(SEQIDNO3)。miR16小分子RNA的核昔酸序列是uagcagcacguaaauauuggcg(SEQIDNO4)。检测miR15和miR16DNA的合适探针分别是CACAAACCATTATGTGCTTGCTA(SEQIDNO5)GCCAATATTTACGTGCTGCTA(SEQIDNO6)SEQIDNO:5禾PSEQIDNO:6的互补序列也可以用作miR15和miR16DNA的探针。
制备标记的DNA和RNA探针的方法,以及与靶核苷酸序列杂交的条件如MolecularCloninR:ALaboratoryManual,.,eds.,2ndedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989,Chapters10and11所述,在此弓I入作为参考。例如,核酸探针可以用例如放射性核素如力,邛,吁,吨或;重金属;或者能与标记的配体特异性结合的配体(例如生物素,抗生物素蛋白或抗体),荧光分子,化学发光分子,酶等物质进行标记。可以用Rigbyetal.(1977),:237-251所述的缺口平移法或Fienbergetal.(1983),:6_13所述的随机引物法获得高比活性的标记探针,在此引入其全文作为参考。后者则是从单链
DNA或RNA模板合成高比活性32P标记的探针的方法。例如,根据缺口平移法,通过用具有高放射活性的核苷酸替换已存在的核苷酸,可以制备得具有超过108cpm/mg的比活性的32P标记的核酸探针。然后将杂交膜曝光在胶片上,进行放射自显影检测。对杂交膜曝光的胶片进行光密度扫描,得到miR15或miR16基因拷贝数的精确测量结果。而且miR15或miR16基因拷贝数还可以用计算机成像系统,例如AmershamBiosciences,Piscataway,NJ的MolecularDynamics400-B2DPhosphorimager进行定量分析。如果无法用放射性核素对DNA或RNA探针进行标记,可以使用随机引物法将dTTP类似物5-(N-(N-生物素基一氨基己酸基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿嘧啶三磷酸盐引入到探针分子中。生物素化的探针寡核苷酸可以通过与与荧光染色或能产生颜色反应的酶偶连的生物素结合蛋白如抗生物素蛋白,抗生物素蛋白链菌素,或抗生物素抗体反应来检测。miR15或miR16基因的缺失或突变还可以通过用聚合酶链式反应(PCR)扩增这些基因的片段,用测序或电泳分析扩增的片段以确定患者DNA样品的扩增片段的序列和/或长度是否和对照DNA样品有所不同来检测。本领域普通技术人员可以容易地确定DN***段的PCR扩增的合适反应和循环条件。如下所述的实施例中使用的方法给出了典型的PCR反应和循环条件。