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专利名称::用于治疗癌症的方法和组合物的制作方法
技术领域:
:本发明涉及医药、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。本发明涉及医药领域。具体地,本发明涉及诸如癌症的疾病的治疗和诊断,以及用于此应用的组合物。
背景技术:
:蛋白质磷酸酶2A(PP2A)作为包含催化亚基C、结构亚基A和大量调节亚基B中的一种的多聚体酶而发挥作用。真核细胞包含200多种在生化上各不相同的PP2A复合体,其源自A、B、C以及其他亚基的不同组合。调节亚基以组织特异性的方式表达,导致不同的哺乳动物组织中存在不同的PP2A复合体(VirshupandShenolikar,2009)。此外,提供底物特异性并催化不同的去磷酸化事件以产生不同的功能结果的是这些调节亚基而不是催化亚基。尽管已经在多种永生化人细胞类型中证明了PP2A的肿瘤抑制作用(Chenetal.,2004;Eichhornetal.,2009;JanssensandGoris,2001;Rangarajanetal.,2004;Sablinaetal.,2007;Zhaoetal.,2003),但尚没有针对PP2A在人恶性病中普遍失活的遗传学和/或表观遗传学证据。可导致丧失B亚基结合的PP2A复合体的A亚基的体细胞突变(Ruedigeretal.,2001)仅见于占15%的某些人癌症中
(Calinetal.,2000;Ruedigeretal.,2001;Takagietal.,2000;Tamakietal.,2004;Wangetal.,1998;WestermarckandHahn,2008),且仅在某些癌细胞系中报道了PP2A亚基B56Y3的表达下降(Chenetal.,2004;Zhaoetal.,2003)。总而言之,如同其对癌症信号转导或靶向治疗的治疗响应的影响,PP2A复合体在人癌症中的遗传学或表观遗传学变化仍有待阐释。PP2A调控的癌症信号转导途径之一是mTOR途径,mTOR是很多癌症细胞所依赖以获得生长优势的PI3K途径的关键组分(GuertinandSabatini,2007;Sabatini,2006)。尽管小分子mTORCl抑制剂,例如雷帕霉素(rapamycin)及其类似物已经显示了其在癌症治疗应用中的合理前景并且已经批准用于临床应用(GuertinandSabatini,2007;Hudesetal.,2007),但这些抑制剂仅取得了有限的成功,且临床结果无法预测。由于已知的雷帕霉素抗性机理将其与其通过PI3K和mT0RC2的AKT磷酸化的反馈激活相联(O’Reillyetal.,2006;Sarbassovetal.,2006),因此,关于抗性机理的进一步理解和鉴定有助于预测治疗响应的生物标记成为了重要话题(Maoetal.,2008;Scottetal.,2009;Thomasetal.,2006)。
发明内容本发明描述了在人结肠直肠癌(CRC)中,启动子DNA的高***使PP2A全酶的B亚基PPP2R2B(其编码B55β)在表观遗传学上失活。本发明人证明了PP2A-PPP2R2B复合体通过减轻
I3DKl指导的Myc磷酸化而发挥肿瘤抑制剂的作用。CRC中导致雷帕霉素抗性的这种特异性ΡΡ2Α复合体的丧失产生了响应mTORCl抑制剂雷帕霉素的强的Myc磷酸化。令人感兴趣的是,不同于雷帕霉素诱导的AKT磷酸化,雷帕霉素诱导的Myc磷酸化不需要P13KCA,但依赖I3DKl。因此,本发明人发现了控制TOKl-Myc信号转导的新肿瘤抑制机理,并且证明了此调控中的缺陷产生对基于mTOR的癌症疗法的抗性。根据本发明的第一方面,本发明人提供了用于测定癌细胞是否可能对mTOR抑制剂治疗具有抗性的方法,所述方法包括检测所述细胞中或所述细胞的(i)PPP2R2B(GenBank登录号NM_181678),或(ii)TOKl(GenBank登录号NM_002613),或以上二者。所述方法可包括检测所述细胞中或所述细胞的PPP2R2B启动子的***化。所述方法可包括检测PPP2R2B启动子的高***。所述***化或高***可与没有mTOR抑制剂抗性的癌细胞进行比较。检测到高***可表明所述癌细胞可能对mTOR抑制剂的治疗具有抗性。所述方法可包括检测所述细胞中PPP2R2B或F1DKl或以上二者的表达或活性。所述TOKl活性可包括I3DKl介导的Myc磷酸化活性。所述方法可以是与没有mTOR抑制剂抗性的癌细胞相比之下PPP2R2B表达和/或活性的下降表明,所述癌细胞可能对mTOR抑制剂的治疗具有抗性。所述方法可以是与没有mTOR抑制剂抗性的癌细胞相比之下TOKl表达和/或活性的升高表明,所述癌细胞可能对
mTOR抑制剂的治疗具有抗性。根据本发明的第二方面,本文提供了为患有癌症或疑似患有癌症的个体选择治疗的方法,所述方法包括(a)提供所述患者的细胞;(b)通过上文所述的方法检测所述细胞的mTOR抑制剂抗性;和(c)在所述细胞被确定为没有mTOR抑制剂抗性的情况下,选择mTOR抑制剂对所述个体进行治疗,在所述细胞被确定为具有mTOR抑制剂抗性的情况下,则为所述个体选择不同的治疗。根据本发明的第三方面,本发明人提供了用于测定患有癌症或疑似患有癌症的个体是否会对mTOR抑制剂治疗作出响应的方法。所述方法可包括对所述个体的细胞实施如上文所述的方法。所述方法可包括,在所述细胞被确定为没有mTOR抑制剂抗性的情况下,确定所述个体可能对mTOR抑制剂治疗作出响应。在本发明的第四方面,提供了提高癌细胞对mTOR抑制剂治疗的敏感性的方法,所述方法包括提高所述细胞中或所述细胞的PPP2R2B表达和/或活性,或降低TOKl表达和/或活性,或上述二者。根据本发明的第五方面,本发明人提供了用于治疗或预防患有癌症或疑似患有癌症的个体的癌症的方法,所述方法包括提高所述个体中或所述个体的PPP2R2B表达和/或活性,或降低F1DKl表达和/或活性,或上述二者。所述方法可以是通过减少PPP2R2B启动子的***化而提高PPP2R2B的表达。可通过使所述细胞暴露于,或向患者施用去***化试剂,例如5-aza-dC或阿扎胞苷
(Azacitidine)而实现所述PPP2R2B启动子的***化。所述方法可包括使所述细胞暴露于,或向患者施用I3DKl抑制剂,例如BX912(CAS登录号702674-56-4)或BX795(CAS登录号702675-74-9)。在第六方面,本发明提供了用于治疗或预防患有癌症或疑似患有癌症的个体的癌症的方法,所述方法包括施用I3DKl表达和/或活性的抑制剂和mTOR抑制剂。在本发明的第七方面,提供了I3DKl表达和/或活性的抑制剂和mTOR抑制剂的组合,其用在治疗或预防癌症的方法中。根据本发明的第八方面,本发明人提供了TOKl表达和/或活性的抑制剂和mTOR抑制剂的组合在制备用于治疗或预防癌症的药物中的应用。根据本发明的第九方面,本发明人提供了PPP2R2B或TOKl或以上二者的应用,其作为用于癌细胞对mTOR抑制剂的敏感性的生物标记,或作为用于结肠直肠癌(CRC),例如雷帕霉素抗性结肠直肠癌的生物标记。所述mTOR抑制剂可包括雷帕霉素或其衍生物。所述I3DKl抑制剂可包括shRNA、BX912或BX795(或其任意组合)。根据本发明的第十方面,提供了TOKl或其拮抗剂,其用在治疗结肠直肠癌(CRC)的方法中。所述癌症可以选自结肠直肠癌(CRC)、膀胱癌、脑癌和食道癌组成的组,优选结肠直肠癌(CRC)。除非另有指明,可采用本领域普通技术人员能力范围之内的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术实施本发明。此类技术阐述于文献中。参见,例如
,,,1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,Books1—3,ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel,.(1995andperiodicsupplements;CurrentProtocolsinMolecularBiology,,13,and16,JohnWiley&Sons,NewYork,.);,,,1996,DNAIsolationandSequencing:EssentialTechniques,JohnWiley&Sons;’,1990,InSituHybridization:PrinciplesandPractice;0xfordUniversityPress;(Editor),1984,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IrlPress;,MethodsofEnzymology:DNAStructurePartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymologyjAcademicPress;UsingAntibodies:ALaboratoryManual:,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7);Antibodies:ALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2),
,(2001,NewYork,NYjMarcelDekkerjISBN0-8247-0562-9);andLabRefAHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,EditedJaneRoskamsandLindaRodgers,2002,ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。这些通用内容分别通过弓I用并入本文。图I:CRC中启动子DNA的高***使丧失PPP2R2B表达。图IA:通过Illumina阵列分析测定的,在24对源自患者的CRC和配对的正常结肠粘膜中的PPP2R2B差异表达。PPP2R2B-mRNA的表达以相对于log2表示。**p〈。图IB24对结肠直肠肿瘤⑴和配对的正常粘膜(N)中PP2A亚基表达的层次聚类。图IC随机选择的8对人CRC(T)和配对粘膜(N)的PPP2R2B表达的RT-PCR分析。使用β-肌动蛋白作为PCR对照。图ID:与正常结肠组织相比,一系列CRC细胞系中的PPP2R2B、PPP2R2A和PPP2R5C的RT-PCR分析。图IE=CRC细胞系中的PPP2R2B启动子的***化特异性PCR(MSP)分析。图IF8种肿瘤和正常对照中PPP2R2B启动子的MSP分析。图IG=HCTl16和DK0,或使用或没有使用5_AzaC(5μΜ)处理3天的DLDl细胞中PPP2R2B的RT-PCR分析。图IH=HCTl16和DKO细胞中PPP2R2B启动子的MSP分析。图II:通过亚硫酸氢盐-测序分析(BGS)对PPP2R2B启动子的***化分析。所分析的区域如所图所示。箭头指出了转录起始位点。空心圆代表没有***化的
CpG;实心圆表不***化的CpG。图2PPP2R2B作为肿瘤抑制剂的功能取得或损失的分析。图2A:使用抗-Myc标签抗体或抗-B55亚基抗体,对DLD1-PPP2R2B细胞的内源Β55α和异位B55i3_Myc的免疫印迹分析。(Doxycycline,Dox)处理细胞3天。图2B:使用或没有使用Dox处理96小时的DLD1-PPP2R2B或载体对照细胞的SA-β-gal分析。比例尺=100μm。图2C:使用或没有使用Dox处理96小时的DLD1-PPP2R2B或载体对照细胞的BrdU掺入。所显示的是三个独立试验的平均值+.。#ρ〈。图2D:通过软琼脂试验评估使用或没有使用Dox处理12天的DLD1-PPP2R2B或HCTl16-PPP2R2B细胞的锚定独立性生长(Anchorageindependentgrowth)。图2E:按照试验方法中的描述,每天使用100mg/kgDox处理的裸鼠中DLD1-PPP2R2B或对照细胞的移植瘤生长。.。图2F和图2G:使用PPP2R2BSmartPoolsiRNA(SP)或独立的PPP2R2BsiRNA转染HEK-TERV细胞,通过Taqman试验(图2F)评估PPP2R2BmRNA,并通过软琼脂试验评估集落形成能力(图2G)。左侧显示的是三个独立试验的代表图。使用表达SV40小抗原(ST)的HEK-TERV细胞作为阳性对照。图3PPP2R2B-PP2A复合体的恢复导致p70S6K和Myc磷酸化的抑制。图3A:在存在或缺失Dox48小时的情况下,HCT116-PPP2R2B或载体对照细胞的所示蛋白的免疫印迹分析。图
3B和图3C:使用或没有使用Dox处理所示时间长度时,DLD1-PPP2R2B或载体对照细胞的免疫印迹分析。图3DPP2A结构亚基A和催化亚基C与PPP2R2B的免疫共沉淀。使用Dox处理DLD1-PPP2R2B或载体对照细胞,且使用抗Myc-标签的抗体对PPP2R2B进行免疫沉淀。WCL,全细胞裂解物。图3EDLD1-PPP2R2B或载体对照细胞的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性。测量来自三个独立试验的PPP2R2B-Myc免疫沉淀物的蛋白磷酸酶活性,一式三份。图3F:在有或没有Dox处理的情况下,经PPP2R1AsiRNA或阴性对照siRNA处理的DLD1-PPP2R2B细胞的Myc和p70S6K的免疫印迹分析。图3G:使用Myc或p70S6KsiRNA或阴性对照siRNA处理所示天数的HCTl16和DLDl细胞的生长曲线。图4:PPP2R2B在CRC中的重表达导致体外和体内的雷帕霉素敏感性,且抑制了(override)雷帕霉素诱导的Myc磷酸化。图4A:使用10ng/mlDox(Dox)或IOnM雷帕霉素或以上二者(R+D)处理所示天数的DLD1-PPP2R2B细胞的增殖。图4B:在有或没有10ng/mlDox处理的情况下,经IOnM雷帕霉素处理的DLD1-PPP2R2B或DLDl载体对照细胞的单层上14天的密集集落形成。图4C:使用Dox或雷帕霉素或以上二者处理48小时的DLD1-PPP2R2B或载体对照细胞的G2/M细胞周期停滞。图4D:按照试验方法中的描述,每隔一天使用100mg/kgDox或4mg/kg雷帕霉素或以上二者处理的裸鼠中DLD1-PPP2R2B细胞的移植瘤生长。误差线代表
SEM。_p〈。图4E:在存在或缺失Dox的情况下,使用IOnM雷帕霉素处理DLD1-PPP2R2B或DLDl载体对照细胞48小时。免疫印迹分析显示,雷帕霉素诱导了Myc磷酸化,其在PPP2R2B表达后消失。图4F:使用IOnM雷帕霉素处理所示时间的DLDl细胞中所示蛋白的免疫印迹分析。图4G:使用祀向mTOR、raptor或rictor的shRNA处理的DLDl细胞中Myc的免疫印迹分析。图5:雷帕霉素诱导的Myc磷酸化需要DK1,但不需要PIK3CA-AKT。图5A=DLDl细胞中AKT和Myc的免疫印迹分析。使DLDl细胞血清饥饿48小时,随后使用IOnM雷帕霉素处理所示时间。图5B:响应双重mTORCl和PllOa抑制剂PI-103()处理所示时间的DLDl细胞中AKT和Myc的免疫印迹分析。图5C=DLDl细胞中Myc、AKT、PI3K或TOKl的免疫印迹分析。使用靶向所示基因的siRNA或阴性对照siRNA转染细胞48小时,随后使用IOnM雷帕霉素处理24小时。图:使用两种不同的TOKlsiRNA或阴性对照siRNA转染,随后使用IOnM雷帕霉素处理24小时的DLDl细胞中TOKUMyc和AKT的免疫印迹分析。图5E:使用逆转录I3DKlshRNA感染的SW480细胞中PDK1、Myc和AKT的免疫印迹分析。图5F:使用PDKl抑制剂BX912(),或PIK3CA抑制剂ΡΙΚ90(5μΜ)、雷帕霉素(IOnM)或所示组合处理48小时的DLDl细胞中Myc、AKT和S6K的免疫印迹分析。图6PPP2R2B与TOKl结合并抑制其在