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专利名称:用于植物体内基因表达的嵌合调节区和基因盒的制作方法
背景技术:
本发明涉及用于调控植物体内基因表达的嵌合调节区。这些嵌合调节区来源于植物病原体根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefa-ciens)的冠瘿碱合成酶基因。
根癌土壤杆菌是一种革兰氏阴性土壤菌,它能感染大多数双子叶植物和某些单子叶植物。由根癌土壤杆菌引起的感染常会导致在被感染植物中形成冠瘿瘤。
在根癌土壤杆菌感染过程中,大的瘤诱导质粒(“Ti”)中一特定DN***段(“T-DNA”)转移至易感植物细胞中并整合入细胞核基因组,由此使T-DNA表达。有些T-DNA基因编码涉及合成植物体内活性激素的酶。这些激素会在被感染植物中引起肿瘤。其它T-DNA基因指导合成与分泌特有的氨基酸和糖的衍生物,即冠瘿碱。根癌土壤杆菌可利用这些冠瘿碱作为碳源,并有时作为氮源。参见Gelvin,-85(1990);Gelvin,TRANSGENICPLANTS(AcademicPress1993);Ream,-618(1989);Zambryski,-90(1992)。
T-DNA基因含有在植物环境中具有功能,并与植物调节区相似的区域。例如,大多数植物启动子含有诸如上游激活序列
(“UAS”)的顺式作用元件(通常称为“增强子”),它们通过与反式作用因子结合来确定或影响启动子的强度和组织特异性表达方式。参见Atchison,-53(1988)。顺式作用元件的组合和空间取向以及可以与这些元件相互作用的核因子的存在会影响某一给定启动子的总体强度和它的表达方式。参见Dynan,Cell581-4(1989)。虽然T-DNA基因原先位于原核质粒上,但它具有在植物体内进行转录所需的全部序列元件(启动子和UAS)。例如,T-DNA基因具有确定转录起始位置的TATA盒序列,而且通常含有位于离转录起始位点100bp以上处的上游元件,这些元件调节转录水平。参见Gelvin,TRANSGENICPLANTS(AcademicPress1993)。
章鱼碱合成酶(ocs)和甘露碱合成酶(mas)基因是两种含有上游激活序列的T-DNA基因。ocs基因编码的产物将精氨酸和***酸缩合成章鱼碱。参见Hack和Kemp,-55(1980)。位于ocs基因上游的一个16碱基对回文序列能在一瞬时表达系统中激活异源的玉米adh1启动子。参见Ellis等,-16(1987);Ellis等,-08(1987)。该回文序列也是激活已稳定转化的烟草愈伤组织中ocs启动子所必需的。参见Leisner和Gelvin,′-57(1988);
Leisner和Gelvin,PlantCell1925-36(1989)。
mas1′和2′基因共有一个双重双向启动子和一个479bp的基因间隔区。这些基因编码用于两步法合成甘露碱的酶。参见Ellis等,-73(1984);Komro等,--63(1985)。两个mas基因的转录呈背离式,基因间隔区包含了两种基因转录所需的全部顺式作用元件。参见DiRita和Gelvin,-41(1987);Fox等,-33(1992);Leung等,-74(1991);Guevara-Garcia等,-505(1993)。
ocs和mas基因的启动子已被用于指导连锁基因在转基因植物中的表达。但是,这些启动子的应用由于在转基因植物某些组织中的弱表达水平而受到限制。参见DiRita和Gelvin,同上;Harpster等,-90(1988);Sznger等,--43(1990)。例如,ocs启动子在转基因烟草中指导一种明显的细胞特异性的表达方式。参见Kononowicz等,PlantCell417-27(1992)。mas基因在叶和茎中呈现弱表达,但在根中的表现较强,并表现出一定程度的创伤和植物生长素诱导性。参见Langridge等,′-94(1989);Teeri等,EMBOJ.,8343-50(1989);Saito等,Planta18440-46(1991);Gue-vara-Garcia等,。
因为启动子和其它调节区表现出不同的强度和组织特异性,所以发展了某些重组调节区。例如,与某些反式作用因子特异性结合的增强子可调控转录活性和细胞特异性的表达方式。参见Bienz和Pelham,Cell45753-60(1986)。
某些组成型启动子如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S结构的使用也是已知的。CaMV35S启动子含有活化剂,活化剂具有多个结构域,能功能性地以一种发展性和组织特异性的方式激活35S启动子。参见Benfey等,-2202(1989);Benfey等,-1684(1990);Benfey等,-96。
Koziel等在Bio/Technology11194-199(1993)中主要涉及在试图获得异源基因的组织特异性启动作用的一个启动子组套结构中所使用的启动子。Koziel给出了一种基因表达系统的结构,它具有一个与CaMV35S启动子或与衍生自玉米的两种组织特异性启动子(磷酸烯醇***酸羧化酶(“PEPC”)启动子和花粉特异性启动子)组合体连接的截短的cryIA(b)基因(该基因片段编码苏芸金杆菌(Bacillusthuringiensis)产生的一种1155个氨基酸杀虫蛋白的前648个氨基酸)。Koziel报导了两种启动子构型的高水平表达。Koziel等还使用了(1)已知引起绿色组织特异性表达的PEPC启动子和(2)玉米花粉特异性启动子。观察到的1500-4000ng/mg杀虫蛋白的表达是一种相当高水平的表达。另外,
PEPC/花粉特异性启动子的使用产生了组织特异性表达。
有人还尝试利用其它技术进行重组表达。Bevan等在PCT/GB92/00566(1992)中主要涉及与Koziel等人的启动子不同的一种单个启动子的非组套性应用,以获取异源基因的组织特异性表达。该申请主要涉及利用菜豆苯丙氨酸氨裂解酶(“PAL”)启动子来产生组织特异性表达。将PAL基因组克隆(即除编码序列外,还含有作为PAL基因序列一部分的间插序列的克隆)的“假定转录调节区”、PAL蛋白氨基端68个氨基酸构成的开放式阅读框架(“ORF”)和完整的β-葡糖苷酸酶(“GUS”)ORF以及其后的胭脂碱合成酶的聚腺苷酸化和转录终止区(通常在大多数真核植物表达载体中将后两种元件融合以确保有效表达)融合构建一个杂交基因。这种最初的结构的确在某些植物中表现出较强的活性,研究者后来在杂交基因的PAL启动子区进行了一些删除。充分表达所必需的最短PAL启动子被发现是从PAL的转录起始位点起的253碱基对。研究者发现通过主要改变此最短区域内的缺失方式,可在一定程度上调节组织特异性表达。
,034,322主要涉及胭脂碱合成酶启动子与一核***糖-1,5-双-磷酸酯羧化酶小亚基基因的利用。
还报导道一种被称为“Mac”的嵌合启动子,它将+65至-301的mas区和-90至-941的35S增强子区结合,表现出数倍于转基因烟草植株中双倍CaMV35S启动子的GUS活性。参见
Comai等,-81(1990)。
上述构建物在表达效率和调控性方面表现出了某些限制。例如,已有方法不能在需要时进行类似于组成型方式的强效表达。
发明概述本发明目的之一是提供改善植物体内基因表达的嵌合调节区。
本发明目的之二是提供由根癌土壤杆菌的启动子和上游激活序列构成的嵌合调节区。
本发明目的之三是提供含有在由根癌土壤杆菌的启动子和上游激活序列构成的嵌合调节区调控下进行表达的基因的基因盒。
本发明目的之四是提供外源基因在植物体内的诱导型表达。
本发明的另一目的是提供含有基因盒的质粒和转基因植物。
在实现上述及其它目的的过程中,根据本发明的一方面内容,提供了一种用于植物体内基因表达的嵌合调节区,其构成是将衍生自第一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的上游激活序列与衍生自不同于第一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的第二种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的启动子进行可操作性地连接。第一和第二种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因最好是甘露碱合成酶基因或章鱼碱合成酶基因。
根据本发明的另一方面内容,提供了一种用于植物体内基因表达的嵌合调节区,其构成是将至少两种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶上游激活序列与一种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶启动子可操作性地连接。上游激活序列可衍生自相同或不同的根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因,例如甘露碱合成酶和章鱼碱合成酶。另外,上游激活序列之一或两者和启动子可衍生自相同的根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因。
根据本发明的另一方面内容,提供了一种基因盒,它含有一个与前述嵌合调节区可操作性地连接的待表达基因。基因盒还可包括转录终止子和聚腺苷酸化信号,如胭脂碱合成酶聚腺苷酸化信号。
根据本发明的另一方面内容,提供了一种用于外源基因诱导型表达的基因盒,其中将一种外源基因与由衍生自根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的启动子及衍生自根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的上游激活序列构成的调节区有操作性地连接。该调节区也可含有一段衍生自根癌土壤杆菌章鱼碱合成酶基因的上游激活序列。
根据本发明的另一方面内容,提供了一种在植物体内进行基因表达的方法,包括将某一基因与本发明的嵌合调节区连接、将该基因和嵌合调节区插入植物体内以及允许在植物体内表达该基因等步骤。
根据本发明的另一方面内容,提供了一种含有本发明的嵌合调节区和基因盒的质粒和转基因植物。
本发明的其它目的、特征和优点将由本文中的论述、数据和图表而变得显而易见。
附图简述
图1表示了以mas和ocs为基础的嵌合调节区的结构。箭头所示为mas或ocs启动子的上游激活序列的取向。数字表示相对于转录起始位点的核苷酸位置。在结构3和4中使用了ocs上游激活序列的三聚体。在结构5和6中使用了ocs上游激活序列的单体或三聚体。
图2表示了烟草原初转化子提取液中以mas启动子为基础结构的GUS活性。利用由叶(图A)、茎(图B)或根组织(图C)制备的总蛋白来测定GUS活性。每一栏代表一单个转化子的活性。不同的结构如图底所示。用于每一种结构分析的转基因植株数量由“n.”表示。每一种结构的GUS活性平均值由“x.”表示。A=激活序列;P=启动子;(Aocs)3=ocs激活序列的三聚体。
图3表示了烟草原初转化子提取液中以mas启动子加上激活序列为基础结构的GUS活性。利用由叶(图A)、茎(图B)或根组织(图C)制备的总蛋白来测定GUS活性。每一栏代表一单个转化子的活性。不同的结构如图底所示。用于每一种结构分析的转基因植株数量由“n.”表示。每一种结构的GUS活性的平均值由“x.”表示。A=激活序列;P=启动子;AocsAmasPmas=ocs激活序列单体与mas激活序列加上启动子连接;(Aocs)3AmasPmas=ocs激活序列的三聚体与mas激活序列加上启动子连接。
图4表示以烟草原初转化子提取液中以ocs启动子为基础结构的GUS活性。利用由叶(图A)、茎(图B)或根组织(图C)制备的总蛋白来测定GUS活性。每一栏代表一单个转化子的活性。不同的结构如图底所示。用于每一种结构分析的转基因植株数量由“n.”表示。每一种结构的GUS活性平均值由“x.”表示。A=激活序列;P=启动子;Amas′=mas区-213至-318;Amas″=mas区-111至-318。
图5表示以烟草原初转化子提取液中以ocs启动子加上激活序列为基础结构的GUS活性。利用由叶(图A)、茎(图B)或根组织(图C)制备的总蛋白来测定GUS活性。每一栏代表一单个转化子的活性。不同的结构如图底所示。用于每一种结构分析的转基因植株数量由“n.”表示。每一种结构GUS活性的平均值由“x.”表示。A=激活序列;P=启动子;Amas′=mas区-213至-318;Amas″=mas区-111至-318。
图6表示双倍35S和Mac启动子在几种转基因烟草植株的叶(双倍35SL、MacL)、茎(双倍35SS、Macs)和根(双倍35SR、MacR)中GUS活性表达的大致水平。
图7表示了用于诱导型表达研究的结构。“UAS”=上游激活序列;“pmas”=mas启动子;“GUS”=β-葡糖苷酸酶基因;“NOS”=胭脂碱合成酶聚腺苷酸信号序列。
图8表示纯化的成熟线虫卵中GUS活性水平。
进行测定以检查细菌或动物的GUS活性。
图9表示各种转基因植物中线虫诱导的GUS活性。A块对应于具有Pmas启动子但无激活序列的转基因植物。B块对应于具有一个AmasPmas启动子的转基因植物。C块对应于具有一个Aoc-sAmasPmas启动子的转基因植物。
优选实施例的具体说明本发明涉及用于调控外源基因表达的嵌合型调节区,它由各种根癌土壤杆菌冠瘿碱合成酶基因的上游激活序列和启动子构成。外源基因包括欲在转基因植物中表达的任何DNA。本文中,不论何种来源的基因均被插入植物基因组中,所以插入位置对该植株来说是外源性的,即使该基因起源于被转化植株。,067中也揭示了根据本发明的新结构,在此引作参考。
对本发明而言,任何类型的基因编码产物都可用于本发明中。在本发明的转基因植物中进行表达的外源基因包括但不限于β-葡糖苷酸酶;编码杀虫和杀真菌***的基因;病原体抗性化合物;超敏反应化合物,例如过氧化物酶、葡聚糖酶和几丁质酶以及植物抗***;杀虫剂、除草剂和杀真菌剂耐受性基因;植物酶,例如那些与蛋白质、淀粉、糖和脂肪成分有关的酶;植物酶抑制剂,如蛋白酶和淀粉酶抑制剂;植物激素;昆虫激素和信息素;药物和营养化合物,如β-胡萝卜素;维生素和抗体,包括抗体的片段和单链衍生物;干扰植物体内现有核苷酸序列的反义转录产物。参见