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专利名称:用于检测烟草青枯病菌的引物、探针及实时荧光pcr试剂盒的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种适合于农业生产、植物保护等部门使用的生物工程技术,特别是一种用于检测烟草生产中的重大毁灭性土传病害一一烟草青枯病病原菌Wa7"o/7/sso7a/acear"/7的引物、探针及实时荧光PCR试剂盒。
背景技术:
烟草青枯病是影响全球烟草产业发展的重大毁灭性病害,在我国各地发生较为普遍。植株根、茎、叶均可受害,其最典型的症状是枯萎。由于植株感病枯萎很快,而叶片萎垂仍呈青绿色,故称青枯病。该病一旦发生即可造成全株死亡,特别在苗期,此病常致幼苗成片枯死,造成大量缺苗,对烟草的产量和质量影响极大。此病害以土传为主,风雨、流水、农事操作等都是其传播途径。对于烟草青枯病菌的检测方法有典型症状目测法、组织病理切片法、致病性测定法等常规检测方法。常规方法的优点在于直观、简便易行,但其缺点在于检测周期长,经验不足者误判率高,而且不能在病原侵染初期进行检测。此外,对烟草青枯病菌的检测还有酶联免疫吸附法、斑点免疫吸附法等,但存在过程复杂、灵敏度低、检测成本
高、周期较长等问题。继常规PCR检测技术之后,新兴的实时荧光定量PCR技术凭借其对初始模板量准确定量、灵敏度高、特异性强、闭管操作、简便迅速等优点,已经成为国内外分子生物学研究中的主流技术,它同样也在植物病原体的检测和诊断中逐渐得到了广泛使用。近年来国内外陆续开始将实时荧光PCR技术应用于植物病害诊断检测。实时定量荧光PCR是利用荧光信号伴随着PCR产物的增加而增强的原理,在PCR扩增过程中,连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。根据荧光信号基线的平均值和平均标准差,%的置信度时计算出大于平均值的荧光值即阈值,然后收集荧光信号增强到预定阈值时的PCR循环次数(即Ct值)。该参数和PCR反应体系中起始DNA模板量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度稀释标准品的ct值绘制成标准曲线,再根据检测样品的ct值就可以准确地测定耙标病原菌的起始模板拷贝数。实时荧光PCR根据其产生荧光的原理分为使用探针和不使用探针的两类方法。由于探针与待检测病原菌DNA序列有很高的特异性,而且可以有效避免常规PCR的假阳性问题,所以目前使用较为普遍的是荧光标记探针法。实时荧光PCR检测方法用于植物病原菌的检测,在国内外都还是刚刚起步。目前,在烟草青枯病菌的实时荧光PCR检测中,以5'-CCGACACCACGACCCTGAA-3,禾口5,-GCGGACGGATAGATGTAGTTGC-3
,为引物、以在5,-ACCTGGCATACCTTGGCGACACC-3,两端向上游移位2个碱基或下游移位3个碱基区域内的任意一条核苷酸序列为探针制备成相应的实时荧光PCR试剂盒,尚无相关报道。发明内容本发明的目的之一就是提供一种用于检测烟草青枯病菌的引物,它可以在PCR检测过程中,定性检测烟草青枯病菌,而且特异性强。,,:5,-CCGACACCACGACCCTGAA-3,;,:5,-GCGGACGGATAGATGTAGTTGC-3,。申请人是经过长期大量的实验,,其扩增片段大小为331bp。该引物的特点是对烟草青枯病菌具有高度的保守性,与其它近缘生物种之间不具有显著的同源性,用该引物进行PCR扩增,实现烟草青枯病菌的准确定性检测,且特异性强。本发明的目的之二就是提供一种用于检测烟草青枯病菌的探针,它可以在实时荧光PCR检测过程中,定量检测烟草青枯病菌,显著地提高检测灵敏度。该探针的碱基序列是在5'-ACCTGGCATACCTTGGCGACACC-3,两端向上游移位2个碱基或下游移位3个碱基区域内的任意一条核苷
酸序列,所述探针一端连接有荧光淬灭基团,另一端连接有荧光报告基团。所述探针荧光报告基团标记在5'端,荧光淬灭基团标记在3'端,构成荧光标记探针。所述探针是在5,-ACCTGGCATACCTTGGCGACACC-3'向上游移位2个碱基的核苷酸序列5,-CCACCTGGCATACCTTGGCGACACC-3,,见序列表中的序列4所示。所述探针的核苷酸序列是序列表中的序列3所示的序列5,-ACCTGGCATACCTTGGCGACACC-3,。所述探针是在5,-ACCTGGCATACCTTGGCGACACC-3,向下游移位3个碱基的核苷酸序列5,-ACCTGGCATACCTTGGCGACACCGCC_3,,见序列表中的序列5所示。本发明的目的之三就是提供一种利用目的一中的引物和目的二中的探针制成的检测烟草青枯病菌的试剂盒,可以在实时荧光PCR检测过程中,快速、准确地定量检测土壤中和植株上的烟草青枯病菌,而且稳定可靠、灵敏度高。所述试剂盒还包括待测样品提取试剂、定量标准品、实时荧光PCR反应液和检测用品,所述实时荧光PCR反应液包括有如下的组份及其相对应的终浓度PCR缓冲液:10%;MgCl2:;dNTPs:;TaqDNA聚合酶1U/25叱;:|Jmol/L;:;;采用无菌双蒸水调整终浓度。根据实际情况,在实时荧光PCR反应液中各组份采用的是PCR缓冲液是10XPCR缓冲液;MgCl2的初浓度是25mmol/L;dNTPs
的初浓度是5mmol/L;TaqDNA聚合酶的初浓度是1U/叱;;;荧光标记探针的初浓度是5陶ol/L;PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶、、、荧光标记探针的体积比是5:5:2:2:3:3:2。在实时荧光PCR反应液中,各组份采用的是PCR缓冲液是10XPCR缓冲液;MgCl2的初浓度是25咖ol/L;dNTPs的初浓度是10函ol/L;;;;荧光标记探针的初浓度是5Mmol/L;PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶、、、荧光标记探针的体积比是50:50:10:8:15:15:20。采用本发明中的试剂盒,一方面,在待测样品预处理过程中,待测样品提取试剂可以直接提取土壤样品或烟草叶片中的烟草青枯病菌DNA用作PCR扩增模板,节约了时间;另一方面,在待测样品的实时荧光PCR扩增过程中,直接将已按最佳组份及其体积比配制好的实时荧光PCR反应液加入八连管中,既节约了大量的时间,且稳定可靠,从而达到了快速、准确地检测土壤中和植株上的烟草青枯病菌。由于采用了上述技术方案,本发明具有如下的优点(1)特异性强本发明中引物和探针均根据烟草青枯病菌特异性序列设计,并与其它生物种比对,没有显著同源性,检测特异性强;
(2)灵敏度高利用本发明中实时荧光PCR试剂盒对烟草青枯病菌进行检测时,可以准确定量,目标菌DNA在IOng/化-1fg/叱浓度范围内,都有很好的线性关系,灵敏度高;(3)实用性好本发明中实时荧光PCR试剂盒具有开启即用、标准统一、简单方便等优点,可以快速、准确地检测田间土壤中和植株上的烟草青枯病菌,实用性好;(4)应用范围广可以定量检测土壤和植株上的烟草青枯病菌,适用于烟草青枯病菌田间动态监测和病害诊断,同时可用于烟草青枯病菌在烟草植株中的增殖速度和种子带菌的定量检测。综上所述,采用本发明,能在田间带病土壤中和植株上快速、准确地检测烟草青枯病菌,从而为及时采取措施切断病害的侵染源提供准确依据,也可以快速、准确地检测植株上的病害,其意义十分重大。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明在本发明中,,so12,其碱基序列分别是-:5,-CCGACACCACGACCCTGAA-3,,见序列表中的序列1所示;:5,-GCGGACGGATAGATGTAGTTGC-3,,见序列表中的序列2所示。在本发明中,用于检测烟草青枯病菌的探针,它的碱基序列是在5'-ACCTGGCATACCTTGGCGACACC-3'两端向上游移位2个碱基或下游移位3个碱基区域内的任意一条核苷酸序列,在该条核苷酸序列上,荧光报告基团标记在
5'端,荧光淬灭基团标记在3'端,以构成荧光标记探针。,按照探针的设计原理和设计方法,设计出用于烟草青枯病菌实时荧光PCR检测的探针,它的碱基序列是在5,-ACCTGGCATACCTTGGCGACACC-3,两端向上游移位2个碱基或下游移位3个碱基区域内的任意一条核苷酸序列;用所设计的所有探针进行实时荧光PCR扩增,对所设计的探针进行筛选;根据实时荧光PCR扩增的结果,最后筛选出最佳探针。在5,_ACCTGGCATACCTTGGCGACACC-3,向上游移位2个碱基的核苷酸序列可以是5,-CCACCTGGCATACCTTGGCGACACC-3,,见序列表中的序列4所示荧光标记探针的核苷酸序列也可以是5,-ACCTGGCATACCTTGGCGACACC-3',见序列表中的序列3所示,它是最佳实施方式。在5,-ACCTGGCATACCTTGGCGACACC-3'向下游移位3个碱基的核苷酸序列还可以是5,-ACCTGGCATACCTTGGCGACACCGCC_3,,见序列表中的序列5所示。在荧光标记探针的5'端标有记报告基团FAM,3'端标记有荧光淬灭基团TAMRA。当探针完整的时候,报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收,仪器检测不到信号。随着PCR进行,TaqDNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其5'—3'外切核酸酶活性就会将探针切断,报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收,即产生荧光信号,报告基团所释放的荧光可以被定
量检测仪内的荧光计检测,模板每复制一次,就有一个探针被切断,伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系,所以荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。Ct值是PCR过程中荧光量的积累超过基底荧光量的循环数。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线,再根据待测样品的Ct值可准确地定量被检测样品中烟草青枯病菌的浓度,从而显著提高检测灵敏度。本发明所述的检测烟草青枯病菌的试剂盒,它包括有待测样品提取试剂、定量标准品、实时荧光PCR反应液和检测用品,其中实时荧光PCR反应液包括有如下的组份及其相对应的终浓度PCR缓冲液10%;MgCl2:;d證s:;TaqDNA聚合酶:1U/25ML;:;:;;采用无菌双蒸水调整浓度。待测样品提取试剂由TES缓冲液和TE缓冲液组成,TES缓冲液和TE缓冲液均是常规试剂,是根据《精编分子生物学实验指南(第四版)》中相关方法配制而成的。定量标准品包括基于烟草青枯病菌特有核酸序列设计的标准阳性对照模板、无烟草青枯病菌土样和健康植株阴性对照模板。标准阳性对照模板由含有插入目标片段的pMD18-T载体(购自Takara公司)制备而成。,PCR
产物电泳后切胶回收目标片段,与pMD18-T载体于16'C下连接过夜,连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞,转化产物涂布在含有X-gal和IPTG的氨节青霉素平板上培养,挑取白斑,摇菌后采用SDS碱解法提取质粒,通过酶切和测序鉴定阳性克隆。阳性克隆的质粒DNA经紫外分光光度计A^定量,经IOX梯度稀释为IOng-lfg/叱,保存于-20。C。实时荧光PCR反应液包括有如下的组份及其相对应的终浓度PCR缓冲液10%;MgCl2:;dNTPs:;TaqDNA聚合酶1U/25ML;:;:;;采用无菌双蒸水调整浓度。其中,PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶都是PCR常规试剂,均购自北京鼎国生物技术责任有限公司,引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成,荧光标记探针在Takara公司合成。检测用品包括有自封式塑料袋、。在利用目的一中的引物和目的二中的最佳探针的基础上,优化反应体系和反应条件,确定最佳的烟草青枯病菌实时荧光PCR检测体系。本发明优化的实时荧光PCR反应体系总体积为25化,,25咖ol/,5mmol/LdNTPs1ML,1U/^LTaqDNA聚合酶1叱,5Wnol/,5陶ol/L荧光标记探针1叱,无菌双蒸水13叱,DNA模板
1叱。实时荧光PCR采用两步法,扩增反应程序为95。C,4min;然后42个循环,每个循环为95。C,10s,63°C,30s,在每个循环的退火/延伸阶段(63°C)收集荧光。利用本发明中的实时荧光PCR试剂盒对烟草青枯病菌进行检测,包括待测样品预处理和待测样品的实时荧光PCR反应。待测样品PCR扩增模板的制备和待测样品的实时荧光PCR反应。待测样品PCR扩增模板的制备包括土壤样品PCR扩增模板的制备和植株样品PCR扩增模板的制备①土壤样品PCR扩增模板的制备(1),***(PVPP),涡旋30s,再加入3mLDNAextractionbuffer混合均匀;(2)迅速置于-196r:液氮中冰冻2niin,取出后于65。C水浴融解(约3min,注意时间不能太长,融解后马上取出),如此反复2-3次裂解细胞;(3)加入20Pl10mg/ml蛋白酶K、,上下颠倒混匀,置于37'C摇床上振荡30min(225r/min);(4)加入600Pl100g/LSDS,65。C水浴30min,其间每隔5-10min轻轻颠倒混匀;(5)室温离心(12,000r/min)10min,收集上清液,转移到另一新的5mL离心管中;(6),涡旋30s,65。C水浴10min,室温离心(12,000r/min)10min,收集上清液并与前次上清液合并;(7),室温结合20min后,室温离心