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专利名称:用于检测人mthfr基因多态性的引物、探针、荧光pcr试剂盒和方法
技术领域:
本发明属于生物医学临床分子检测领域,、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法。
背景技术:
亚***四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)是甲硫氨酸-叶酸代谢系统中的关键酶,可以使5,10-亚***四氢叶酸还原为5-***四氢叶酸,一方面可以作为***的间接供体参与体内嘌呤、嘧啶的合成及DNA、RNA、蛋白质的***化;另一方面,在甲硫氨酸合成酶的催化下,以维生素B12为辅酶,使血液中同型半胱氨酸再发生***化生产甲硫氨酸,从而维持体内正常的同型半胱氨酸水平。MTHFR基因突变可导致其编码的叶酸代谢关键酶活性降低,引起叶酸代谢障碍,造成叶酸水平降低及高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸可使血管内皮损伤及功能异常,刺激血管平滑肌细胞增生,破坏机体凝血和纤溶系统,使机体处于血栓前状态,而慢性的细胞内同型半胱氨酸水平的升高可导致DNA低***化,染色体异常。近年来发现高同型半胱氨酸水平与包括心脑血管疾病、出生缺陷、妊娠相关疾病、糖尿病等多种疾病缺陷密切相关。
MTHFR基因常见的突变有两种NCBI单核苷酸多态性数据库(dbSNP)(SNPID:rsl801133)(SNPID:rsl801131)。其中,,也是到目前为止发现的MTHFR最为常见的突变位点。研究表明,,其编码的丙氨酸被缬氨酸替代,导致MTHFR酶的热稳定性与酶活性降低,据文献报道,该位点在亚洲人群中突变的频率高达40%。另外,,谷氨酸被丙氨酸取代,同样使MTHFR的酶活性下降,引起血浆同型半胱氨酸水平的升高和叶酸水平的降低,该位点在亚洲人群中突变的频率闻达19%。我国推荐孕期补充量为400微克/天,对于MTHFR基因正常的人,摄取推荐量的叶酸,能够显著降低患儿的出生缺陷率;对于MTHFR基因异常的人,MTHFR酶活性明显降低,叶酸代谢障碍,导致新生儿神经管缺陷、唐氏综合症及唇腭裂等疾病的发病风险明显增高,这类人需要补充更多的叶酸才能达到预期的效果。多年来,国内外对MTHFR多态性基因型进行分析,大多采用PCR-PFLP检测技术和DNA直接测序法。由于PCR-PFLP技术依赖限制性内切酶消化、电泳分析等原因,往往出现结果误判现象,影响其检测准确率,另外其检测周期长、通量较低,亦不适用于大量人群的快速筛
选。另外,作为基因检测金标准的DNA直接测序法,由于其需要昂贵的仪器设备和复杂的操作流程以及检测周期长的特点,难以实现大规模推广。
发明内容
本发明针对现有技术检测MTHFR基因多态性时价格昂贵、周期长、低效率、数据分析繁琐等不足,提供了一种基于实时荧光定量PCR技术平台的MTHFR基因多态性检测的引物和荧光探针、试剂盒及检测方法,(C/T)多态性和/(A/C)多态性,本发明快速、成本低,具有广泛推广价值。为达到上述目的,本发明采用的技术方案是
一种用于检测人MTHFR基因多态性的检测引物及其相应探针,(C/T)多态性设计,序列如下所示
反向引物
MTHFR665C:5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGG-3’();
MTHFR665T:5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGA-3’();正向引物
MTHFR665F:5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’();
荧光探针
TM-MTHFR665:5’荧光基团-TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’淬灭基团(SEQID
)。本发明还提供了一种用于检测MTHFR基因多态性的检测引物及其相应探针,(A/C)多态性设计,序列如下所示
正向引物
MTHFR1286A:5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’();
MTHFR1286C:5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’();
反向引物
MTHFR1286R:5’-TGCCATGTCCACAGCATGGA-3’();
荧光探针
TM-MTHFR1286:5’荧光基团-TCACAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCT-3’淬灭基团(SEQID
)。本发明还提供了一种用于检测人MTHFR基因多态性的内控引物对及相应荧光探针,序列如下所示
内控引物对
正向引物GAPDHF:5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’();
反向引物GAPDHR:5,-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3,();
内控荧光探针
TM-GAPDH:5’荧光基团-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’淬灭基团()。(C/T)多态性的探针、(A/C)多态性的探针以及内控引物对应的荧光探针5’端的荧光基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团,优选FAM,TET,VIC,HEX或R0X,3’端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团,优选BHQ-UBHQ-2,DabcyUEclipse或TAMRA,更优选的方案为检测荧光探针的5’端连有的荧光基团为FAM,3’端连有的淬灭基团为Dabcyl;内控荧光探针的5’端连有的荧光基团为R0X,3’端连有的淬灭基团为BHQ-2。本发明还提供了一种用于检测人MTHFR基因多态性的荧光PCR试剂盒,(C/T)多态性和/)多态性的检测引物和相应的荧光探针和使用说明书。具体的说,(C/T)多态性的两种特异性反应液MTHFR665CPCR反应液与MTHFR665TPCR反应液,和/(A/C)多态性的两种特异性反应液=MTHFR1286APCR反应液与MTHFR1286CPCR反应液;其中PCR反应液包含了
PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP等物质外,还对应的包含上述检测引物与探针。上述各特异性检测的PCR反应液分别包含的引物与探针的序列如下
(1)MTHFR665CPCR反应液
MTHFR665C:5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGG-3’;
MTHFR665F:5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’
TM-MTHFR665:5’荧光基团-TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’淬灭基团(2)MTHFR665TPCR反应液
MTHFR665T:5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGA-3’;
MTHFR665F:5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’
TM-MTHFR665:5’荧光基团-TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’淬灭基团
(3)MTHFR1286APCR反应液
MTHFR1286A:5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’;
MTHFR1286R:5’-TGCCATGTCCACAGCATGGA-3’
TM-MTHFR1286:5’荧光基团-TCACAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCT-3’淬灭基团
(4)MTHFR1286CPCR反应液
MTHFR1286C:5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’;
MTHFR1286R:5’-TGCCATGTCCACAGCATGGA-3’
TM-MTHFR1286:5’荧光基团-TCACAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCT-3’
淬灭基团上述试剂盒的优选方案中各PCR反应液,除了包括检测引物和相应的荧光探针外,还包括一对内控引物及相应荧光探针,内控引物和探针的序列如下
内控引物
GAPDHF:5,-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’
GAPDHR:5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’
内控荧光探针
TM-GAPDH:5’荧光基团-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’淬灭基团。(C/T)多态性的探针、(A/C)多态性的探针以及内控引物对应的荧光探针5’端的荧光基团可以为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团,优选FAM,TET,VIC,HEX或R0X,3’端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团,优选BHQ-UBHQ-2、Dabcyl,Eclipse或TAMRA,更优选的方案为检测荧光探针的5’端连有的荧光基团为FAM,3’端连有的淬灭基团为Dabcyl;内控荧光探针的5’端连有的荧光基团为R0X,3’端连有的淬灭基团为BHQ-2。上述试剂盒使用说明书包含对PCR扩增条件的描述,优选的PCR扩增条件为预变性的条件为温度为95°C,时间为3分钟;
PCR反应由第一阶段和第二阶段构成第一阶段由10次扩增循环构成,其条件为
变性温度为95°c,时间为20秒;
退火起始温度为56°C,时间为30秒;
延伸温度为65°C,时间为45秒;
第二阶段由30次扩增循环构成,其条件为
变性温度为95°C,时间为20秒;
退火温度为56°C,时间为30秒;(设置荧光信号采集)
延伸温度为65°C,时间为45秒。
本发明还提供了一种利用上述检测引物和荧光探针或者上述含有的检测MTHFR基因多态性的荧光PCR试剂盒进行MTHFR基因多态性检测的方法,步骤包括
(O待测样品处理和模板提取
;
,推荐使用商业化的试剂盒提取外周血基因组DNA;
,要求浓度大于lOng/μΙ;0D260nm/0D280nm=。(2)荧光PCR扩增
(C/T)多态性和/(A/C)多态性的检测引物和相应的荧光探针PCR反应液内,在荧光PCR管内混合均匀离心后,放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行
PCR反应,优选将待检测模板DNA与一定量的TaqDNA聚合酶加入含有内控引物及相应荧光探针的上述PCR反应液内(上述试剂盒优选方案),在荧光PCR管内混合均匀离心后放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应,用以监测反应有效性。上述荧光PCR扩增方案优选采用以下温度循环及信号采集程序进行PCR反应
预变性的条件为温度为95°C,时间为3分钟;
PCR反应由第一阶段和第二阶段构成
第一阶段由10次扩增循环构成,其条件为
变性温度为95°c,时间为20秒;
退火起始温度为56°C,时间为30秒;
延伸温度为65°C,时间为45秒;
第二阶段由30次扩增循环构成,其条件为
变性温度为95°C,时间为20秒;
退火温度为56°C,时间为30秒;(设置荧光信号采集)
延伸温度为65°C,时间为45秒。(3)分析结果
在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下,观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增“S,,型曲线,如果形成对数扩增“S”型曲线则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性。(C/T)多态性和/(A/C)多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针在检测人
MTHFR基因多态性中的应用。(C/T)多态性和/(A/C)多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针的试剂盒在检测人MTHFR基因多态性中的应用。本发明所述技术方案中的有关内容解释如下。(AlleleSpecificPCR,ASPCR),又称为等位基因特异性扩增法(AlleleSpecificAmplification,ASA)或者扩增受阻突变系统(AmplificationRefractoryMutationSystemARMS-PCR),其基本原理是由于TaqDNA聚合酶缺少3’一5’外切酶活性,在进行PCR反应时,若引物3’端形成错配,链延伸反应就会因为3’,5’-磷酸二酯键形成的障碍而受阻,导致PCR产物量急剧减少,在一定扩增循环内,不会检测出特异的扩增产物;反之,3’端配对则能够检测出扩增产物。于是,针对已知的多态性位点,将其多态性碱基设计于检测引物的3’端,扩增反应后,通过凝胶电泳观察产物的有无即可判断多态性位点的碱基类型。突光定量PCR是(Real-timePCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新定量实验技术,在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针被称“TaqMan探”,为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告突光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;刚开始时,探针结合在