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用于接种目的的来自eb病毒的第二代病毒样颗粒(vlp)的制作方法
本发明涉及基本不含EB病毒(EBV)DNA的EB病毒样颗粒(EB-VLP)。本发明还涉及包含EBV基因组的多核苷酸,所述EBV基因组:a)缺乏选自BFLF1基因、BBRF1基因、BGRF1基因、BDRF1基因、BALF3基因、BFRF1A基因和BFRF1基因的至少一个可表达基因;和b)在适宜的宿主细胞中产生本发明的EB-VLP。本发明进一步涉及包含本发明的多核苷酸的载体和宿主细胞,以及制备所述EB-VLP的方法、制备其疫苗的方法、包含所述EB-VLP的疫苗和组合物。
【专利说明】用于接种目的的来自EB病毒的第二代病毒样颗粒(VLP)
[0001]本发明涉及基本不含EB病毒(EBV)DNA的EB病毒样颗粒(EB-VLP)。本发明还涉及包含EBV基因组的多核苷酸,所述EBV基因组a)缺乏选自BFLFl基因、BBRFl基因、BGRFl基因、BDRFl基因、BALF3基因、BFRFlA基因和BFRFl基因的至少一个可表达基因,b)在适宜的宿主细胞中产生本发明的EB-VLP。本发明进一步涉及包含本发明的多核苷酸的载体和宿主细胞,以及制备所述EB-VLP的方法、制备其疫苗的方法、包含所述EB-VLP的疫苗和组合物。
[0002]致癌性EB病毒(EBV)隶属于可以潜伏性感染人B淋巴细胞的Y疱疹病毒家族。EBV在超过90%的人群中建立持续终生的B细胞感染(.(2006),Epstein-Barrvirusanditsreplication,),Fieldsvirology,第5版Lippincott-Raven,Philadelphia,-2654中;Kiippers,R.(2003).Bcellsunderinfluence:transformationofBcellsbyEpstein-Barrvirus,:801-812)。在健康个体中,大多数EBV感染的B细胞显示有限的病毒基因表达和静息表型。潜伏性感染的细胞终端分化为浆细胞导致病毒再活化、产生,并再感染B细胞(Laichalk,-Lawson.(2005),TerminaldifferentiationintoplasmacellsinitiatesthereplicativecycleofEpstein-:1296-1307)。所有病毒潜伏基因的表达导致生长转化和感染的B细胞的增殖,其在体外反映为EBV转化的类淋巴母细胞B细胞系的派生,在体内反映为EBV与包括不同类型的淋巴瘤的多种B细胞淋巴组织增生性疾病的相关。如EBV相关恶性肿瘤在先天性或医源诱发性T细胞机能障碍患者中提高的发病率(Rickinson,.(2006),Epstein-Barrvirus,(编辑),Fieldsvirology,第5版Lippincott-Raven,Philadelphia,PA.,2655-2700
中)及通过多克隆EBV特异性T细胞系的输注成功治疗了造血干细胞移植受体中的EBV相关移植后淋巴组织增生性疾病(Rooney,,(1998),InfusionofcytotoxicTcellsforthepreventionandtreatmentofEpstein-Barrvirus-:1549-1555)所显示,EBV感染受T细胞控制。
[0003]因此,本领域中存在发展疫苗来预防或清除EBV感染的需要。这种疫苗将适用于表观健康的个体,所以这种疫苗的安全性将是主要的顾虑。迄今为止,只有抗EBVgp350的肽疫苗可购得。但是,此疫苗的第一期临床试验显示,它未在EBV阴性移植受体中预防EBV感染(ReesL等(2009),AphaseItrialofEpstein-(8):1025-9)。
[0004]病毒样颗粒(VLP)是与成熟病毒粒子相似或相同但缺乏病毒基因组的结构。通常,它们以比例如单体肽高的程度刺激宿主的免疫反应,这就是为什么优先用它们针对几种病毒(如乙型肝炎病毒和乳头瘤病毒)进行接种(Greenstone,(1998),Chimericpapillomavirusvirus-:1800-1805
;Mandic,.(2004).Humanpapillomavirusvaccineasanewwayofpreventingcervicalcancer:adreamorthefuture?:197-200)。VLP疫苗方案的关键安全性方面是,所使用的VLP必须不含病毒基因组(DNA或RNA),因为否则接种可诱发病毒复制和/或病毒的潜伏性感染。
[0005]EBV和其他疱疹病毒的病毒裂解性复制(即导致形成后代病毒颗粒的过程)是由不同蛋白质种类的连续激活引起的复杂过程。在裂解性复制过程中,病毒基因组从不同复制起点扩增几千倍,形成高度分支的结构。然后这些巨大的多联体分解为单位长度的线性病毒基因组,所述单位长度的线性病毒基因组将在感染的细胞核内包装入预先形成的前衣壳。包含病毒DNA的衣壳将经历进一步的构象和结构变化,并作为有包膜的病毒粒子颗粒从感染细胞排出(Roizman,.(2001),Herpessimplexvirusesandtheirreplication,,,,,,(编辑),Fieldsvirology,第4版,2卷Lippincottffilliams&ffilkins,Philadelphia,2399-2459页中)。导致EBV衣壳化的一种必需的顺式元件是位于线性基因组两端的末端重复序列
(TR),其涉及从病毒裂解性复制期间形成的多联体切出单个病毒基因组以及它们的包装。已产生了缺失这些末端重复序列的EBV突变株(delTR-EBV)。已显示,诱导裂解周期后,产生大量空的EB-VLP,基因组衣壳化的效率显著低,因为与使用对照EBV时的29%相比,%用包含delTR-EBV的上清感染的细胞表达来自所述基因组的标记基因(FeederleR等,(2005),Defectiveinfectiousparticlesandrarepackagedgenomesproducedbycellscarryingterminal-repeat-negativeEpstein-;7641-7)。这表明,末端重复序列对基因组衣壳化很重要,但并非绝对必需。此外,已显示,从delTR-EBV产生的VLP仍然(虽然罕见)感染细胞,因此不保证delTR-EBVVLP用作疫苗的安全性。
[0006]总的来说,虽然存在需要,但迄今尚未发展出用于产生针对EBV的安全而有效的疫苗的方法。因此,基于本发明的技术问题可以视为提供允许有效产生EBV疫苗的手段和方法。通过权利要求和下文中表征的实施方案来解决该技术问题。
[0007]因此,本发明涉及基本不含EB病毒(EBV)DNA的EB病毒样颗粒(EB-VLP)。
[0008]本文所用的术语“EB病毒样颗粒”或“EB-VLP”指衍生自在适宜的宿主细胞中既
不裂解性复制也不建立潜伏性感染的EBV的病毒颗粒。优选地,如通过电子显微镜分析,EB-VLP具有基本典型的疱疹病毒结构,即它们具有衣壳、内膜和外膜。但是,与正常的疱疹病毒颗粒不同,本发明的EB-VLP是空的,即它们不含EBVDNA,优选完全没有DNA。EB-VLP包含技术人员就已知EBV类型(例如,I型EBV:Genbank检索号::82503188;基因组:SEQIDNO:1;deJesusO等(2003),1443-1450;及2型EBV:Genbank检索号::139424470;DolanA等(2006)Virology350卷,164-170;基因组现010吣:2,包括毒株厘81姊010吣:38))已知的EBV病毒蛋白质(例如衣壳、内膜、外壳、壳、表面或包膜蛋白质和糖蛋白)。
[0009]除EBV编码的蛋白质外,EB-VLP还可以包含一种或多种人工多肽。术语“人工多肽”指不包含在野生型EBV中的掺入EB-VLP的任意多肽。如果人工多肽掺入并因此包含在EB-VLP中,则可以通过以下来评估:按照本发明的方法获得EB-VLP,例如通过离心或通过下文实施例中所述的免疫沉淀来从产生细胞分离EB-VLP,然后测定该人工多肽在该EB-VLP中的存在,其可以例如通过实施例中所述的免疫印迹法或通过适于具体多肽且为技术人员已知的任意其他方法来实现。
[0010]优选地,该人工多肽是包含疱疹病毒糖蛋白的膜整合部分的融合多肽。更优选地,该人工多肽是包含单纯疱疹病毒
gC蛋白质的跨膜结构域的融合多肽。在优选实施方案中,该人工多肽进一步包含可检测标签。术语“可检测标签”指加至或引入至本发明的融合多肽的一段氨基酸。优选地,该标签将在本发明的融合多肽的C端或N端加入。该一段氨基酸将允许通过特异性识别该标签的抗体来检测该融合多肽,或者它将允许形成功能性构象(如螯合剂),或者它将允许通过突光标签显示。优选的标签是Myc标签、FLAG标签、6_His标签、HA标签、GST标签或GFP标签。这些标签为本领域公知。在另一优选实施方案中,该融合蛋白质包含含有免疫原性蛋白质的氨基酸序列的肽或多肽,该免疫原性蛋白质优选致病微生物的免疫原性蛋白质,更优选EBV蛋白质,最优选潜伏性EBV蛋白质。
[0011]但是,本发明还设想从EB-VLP缺失一种或多种非必需EB病毒多肽。在本说明书的背景中,“非必需EBV多肽”指掺入野生型EB病毒颗粒但并非形成VLP必需的多肽。如果在缺乏该多肽的情况下,在已按照本说明书的方法诱导或产生适宜的宿主细胞来产生VLP之后,通过电子显微镜或本说明书的实施例中所述的其他方法之一可检测到VLP,则该多肽是非必需的。例如,可以从EB-VLP缺失EBVBNRFl基因的产物,其显示在感染后EBV颗粒从内体的逃逸中发挥作用(Feederle,R等(2006),Epstein-(19):9435-43)
。在EBV的裂解性感染过程中从宿主细胞删去多肽的方法为技术人员公知。优选地,通过从病毒基因组删除编码该多肽的基因或通过利用遗传手段(例如通过将起始密码子突变为非起始密码子)致使该基因不可表达来删去多肽。
[0012]本文所用的术语“基本不含EBVDNA”将为本领域技术人员所理解。该术语并非必然指所有EB-VLP都不含EBVDNA。但是,该术语要求,与对照EB-VLP相比,通过本发明的方法产生的不含EBVDNA的EB-VLP的数目增加了统计上显著的部分。对照VLP是上文所述的delTR-EBVVLP。部分是否在统计上显著可以由本领域技术人员用多种公知的统计评价工具(例如确定置信区间、p-值确定、Student’st检验、Mann-Whitney检验等)不费周折地确定。详情见于Dowdy和Wearden,StatisticsforResearch,Johnffiley&Sons,NewYorkl983中。P-、、、。此外,与对照EB-VLP相比,通过本发明的方法产生的含有EBVDNA的EB-VLP的数目优选减少至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或至少10000倍。
[0013]优选地,基本不含EBVDNA的EB-VLP是包含少于10000EBV基因组/ml上清、更优选少于1000EBV基因组/ml
上清、甚至更优选少于100EBV基因组/ml上清和最优选少于10EBV基因组/ml上清(按本说明书的实施例中所述产生并在PCR测定中测定时)的EB-VLP。优选地,EBV基因组的数目小于200/106EBV-VLP、小于100/106EBV_VLP、小于50/106EBV_VLP、小于20/106EBV-VLP、小于10/106EBV-VLP、小于1/106EBV-VLP、-VLP或小于
-VLP。
[0014]优选地,基本不含EBVDNA的EB-VLP是在按照本说明书的实施例中所述产生并在感染测定中测定时,以小于10个感染细胞/ml上清、更优选小于I个感染细胞/ml上清、、-VLP。优选地,该比率小于10个感染Raji细胞/106EB-VLP、更优选小于I个感染细胞/106EB-VLP、-VLP、-VLP。
[0015]优选地,本发明的EB-VLP用作药物。本文所用的术语“用作药物”涉及EB-VLP作为活性剂在诊断、治愈、治疗或预防疾病中的用途。
[0016]还优选地,本发明的EB-VLP用于接种。本文所用的“接种”涉及施用抗原性物质来刺激个体的免疫系统发展适应性免疫。接种是治疗性或预防性接种。
[0017]治疗性接种指为了以显著的程度改善或治愈本文中提到的疾病或障碍或与之相伴的症状而进行的接种。就本文提到的疾病或障碍而言,治疗性接种可以导致完全恢复健康。应理解,按照本发明使用的治疗性接种可以并非在所有个体中都有效。但是,该术语将要求可以成功治疗患有本文中提到的疾病或障碍的个体的统计上显著的部分。部分是否在统计上显著可以由本领域技术人员用多种公知的统计评价工具(例如确定置信区间、P-值确定、Student’st检验、Mann-Whitney检验等)不费周折地确定。优选的置信区间是至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。p-、,,
。优选地,该治疗将对给定群组或群体的至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的个体有效。
[0018]预防性接种涉及为了在个体中就本文提到的疾病或障碍而言在某个时期(优选终生)内保持健康而进行的接种。应理解,该时期取决于已施用的EB-VLP的量及本说明书其他地方讨论的个体的个体因素。应理解,预防性接种可以并非在用本发明的EB-VLP治疗的所有个体中都有效。但是,该术语要求可以有效预防群组或群体的个体的统计上显著的部分免于患上本文提到的疾病或障碍或其伴随症状。优选地,在此背景中设想个体的群组或群体在正常情况(即没有本发明的预防性接种)下将发展本文提到的疾病或障碍。部分是否在统计上显著可以由本领域技术人员用本说明书其他地方所讨论的多种公知的统计评价工具