文档介绍：该【用于多种细菌的基因检测膜条及其引物的制作方法 】是由【开心果】上传分享，文档一共【10】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【用于多种细菌的基因检测膜条及其引物的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。用于多种细菌的基因检测膜条及其引物的制作方法
专利名称:用于多种细菌的基因检测膜条及其引物的制作方法
技术领域:
本发明属于基因检测领域,具体涉及可用于多种细菌的基因检测膜条及其引物。
背景技术:
病原菌引起的感染性、传染性疾病是威胁人类健康和造成社会恐慌的重要因素,快速准确地检测病原菌是有效预防和治疗感染性疾病的关键。常规的生理生化、血清学鉴定方法操作繁琐,周期长,而且某些病原菌培养困难。PCR、ELISA等方法虽然缩短了检测周期,但假阳性率高[1’2],。基因芯片技术的兴起,使快速、微量、准确、高通量地检测病原菌成为可能[3]。基因芯片检测病原菌选取的靶基因一般为16srRNA、16S-23SrRNA、23srRNA的基因等⑷,标记基因的方法有Cy3或Cy5等荧光染料、生物素、***等[4’5]。目前,市场上应用的病原菌检测芯片多采用荧光标记,如天津生物芯片技术有限责任公司出品的系列病原菌检测芯片,北京博奥生物有限公司出品的晶芯食源性致病菌检测试剂盒等。但是,采用荧光标记的基因芯片需要激光共聚焦微阵列扫描仪、基因芯片点样仪等贵重仪器[6],成本高,价格贵。本研究选取10种常见细菌为研究材料,采用16srRNA基因为检测靶基因,
选择多态区设计探针,***纤维素薄膜条作为固定探针的基质,利用生物素标记16srRNA基因扩增片段,PCR扩增片段与膜条杂交后,SA-AP(streptavidinlabledbyalkalinephosphatase,碱性磷酸酶标记的链亲和素)检测生物素标记、NBT(nitrobluetetrazolium,硝基四氮唑蓝)/BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3_IndolylPhosphate,5-溴-4-***-3-吲哚-磷酸)显色的方法,建立起了一种快速、准确、成本较低的细菌检测方法,具有良好的临床应用前景。本研究对感染性疾病的预防、诊断、治疗具有重大的价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于多种细菌的基因检测膜条产品及其检测时所用的引物。建立起了一种快速、准确、成本较低的细菌检测方法,具有良好的临床应用前景。一种用于多种细菌的基因检测膜条,包括用于扩增细菌的16SrRNA基因片段的一对引物250F:CCTACGGGAGGCAGCAGT;1020R:CGGGACTTAACCCAACAT;以及固定有如下所示序列探针中的一种或几种的***纤维素薄膜条,所述探针序列如下大肠埃希菌检测探针TCCACGGAAGTTTTCAGAGATGAGAATGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACA肠道沙门菌检测探针TCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACA粘质沙雷菌检测探针
TCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACA
阴沟肠杆菌检测探针
TCCAGAGAACTTAGCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACA
奇异变形杆菌检测探针
TCCAGCGAATCCTTTAGAGATAGAGGAGTGCCTTCGGGAACGCTGAGACA
铜绿假单胞菌检测探针
TGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACA
鲍曼不动杆菌检测探针
TACTAGAAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAATCTAGATACA
枯草芽孢杆菌检测探针
TCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACA
溶血性葡萄球菌检测探针
TCCTTTGACCCTTCTAGAGATAGAAGTTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGA
金黄色葡萄球菌检测探针
TCCTTTGACAACTCTAGAGATAGAGCCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGA。
所述的引物1020R的5’端被生物素标记)
所述的***纤维素薄膜条还固定有
无序的核酸探针
ATCTGATGCTGCATACGTACTGCATCCGTAACTGCAATGGTACTGTAGCC
细菌通用探针
TGTCGTCAGCTCGTGYYGTGARRTGTYGGSTTAAGTSCCRYAACGAGCGC。
所述的细菌大肠埃希菌,肠道沙门菌,粘质沙雷菌,阴沟肠杆菌,奇异变形杆菌,铜
绿假单胞菌,鲍曼不动杆菌,枯草芽孢杆菌,溶血性葡萄球菌,金黄色葡萄球菌中的一种或几种。目前,市场上有检测细菌的基因芯片,但多为荧光标记[7];也有用于HPV分型的非荧光标记的基因芯片[8_9],但还没有检测临床标本中病原细菌的非荧光标记的基因芯片。一些同行尝试过用生物素或者***标记的基因芯片检测病原菌[5]_,但并没有用到临床实践。由于荧光标记的基因芯片价格高,而非荧光标记的基因芯片又没有产品,所以目前各医院的检验科还是传统的镜检和生化的方法鉴定样本中的病原细菌的种类。本研究选用***纤维素薄膜条作为固定探针的基质,采用生物素标记细菌16SrRNA基因的扩增片段,设计出新的通用引物,以及探针,建立起了一种快速、准确、成本较低的细菌检测方法,可以同时检测一种或多种细菌,具有良好的临床应用前景。
图1为用于鉴定细菌的16SrRNA基因片段扩增M=Marker;1:ddH20;2大肠埃希菌;3肠道沙门菌;4粘质沙雷菌;5阴沟肠杆菌;6奇异变形杆菌;7铜绿假单胞菌;8鲍曼不动杆菌;9枯草芽孢杆菌;10溶血性葡萄球菌;11:金黄色葡萄球菌;图2为用于核酸分子杂交的16SrRNA基因片段扩增
(A)通用引物250F、bio-1020R可以扩增10种细菌的16SrRN***段。M=Marker;1大肠埃希菌;2肠道沙门菌;3粘质沙雷菌;4阴沟肠杆菌;5奇异变形杆菌;6铜绿假单胞菌;7鲍曼不动杆菌;8枯草芽孢杆菌;9溶血性葡萄球菌;10金黄色葡萄球菌;(B)Biotin成功标记反向引物Bio_1020R;图3为10种细菌检测膜条的探针排列顺序Scrambling无序的核酸探针;Universal细菌通用探针;;;;;;;;;;;图4为本发明膜条检测10种细菌A大肠埃希菌;B肠道沙门菌;C
粘质沙雷菌;D阴沟肠杆菌;E奇异变形杆菌;F铜绿假单胞菌;G鲍曼不动杆菌;H枯草芽孢杆菌;I溶血性葡萄球菌J金黄色葡萄球菌;K同时检测5种细菌——大肠埃希菌,肠道沙门菌,粘质沙雷菌,鲍曼不动杆菌,金黄色葡萄球菌。
具体实施例方式以下结合具体实施方式
进一步说明本发明,而非限制本发明。,肠道沙门菌,粘质沙雷菌,阴沟肠杆菌,奇异变形杆菌,铜绿假单胞菌,鲍曼不动杆菌,枯草芽孢杆菌,溶血性葡萄球菌,金黄色葡萄球菌属于常用菌株,购买于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的非专利培养物的保藏库。,37°C震荡培养过夜。次日,,12000rpm离心aiiin。去上清液,加入567μ1的TE缓冲液,震荡重新悬浮细菌。然后,加入30μ110%SDS和15μ120mg/ml蛋白酶Κ(革兰阳性菌需先加入20μ110mg/ml溶菌酶,37°C反应15min后再加入蛋白酶K),混勻,于37°C温育lh,其间多次颠倒混勻。如果溶液变澄清,表示细菌裂解完全。随后,加入100μ15mol/LNaCl和80μ1CTAB(HexadecyltrimethylammoniumBromide,十六烷基三***溴化铵)/NaCl溶液(,需要加热到65°C使之溶解,然后室温保存),混勻,65°C
温育lOmin,可见白色沉淀。然后加入等体积的酚/***仿/异戊醇05241),混勻至乳浊状。12000rpm离心5min,转上清液至一洁净试管,加入与上清液等体积的异丙醇,轻轻混勻,直至产生絮状DNA沉淀。12000rpm离心5min,去上清液,沉淀用Iml的70%乙醇洗涤。离心,弃乙醇,在洁净工作台中干燥沉淀。最后,将沉淀溶于50μ1TE缓冲液,加入ΙμRNaseA(10mg/ml),4°C保存备用。***直接煮沸法取新鲜细菌悬液,加入等体积***,置于沸水浴中煮沸lOmin。然后12000rmp离心aiiin,其上清液即为细菌DNA溶液,可以作为PCR扩增的模板。。建立50μ1PCR反应体系=DNA模板1μ1,,IOXPCR缓冲液5μ1,25mMMgCl22μ1,IOmMdNTP1口1,2(^]引物11μ1,20μΜ引物21μl,5U/。采用PTC-100PeltierThermalCycler(BIO-RAD)进行PCR反应。如采用27F、149扩增16SrRNA基因片段,反应程序为94°C变性5min;94°C变性45s,55°C退火45s,72°C延伸90s,30个循环;72°C延伸7min;4°C保存备用。如采用250F、Bio-1020R扩增16SrRNA基因片段,反应程序为94°C变性5min;94°C变性30s,55°C退火30s,72°C延伸lmin,;35个循环;72°C延伸IOmin;
4°C保存备用。表1扩增16srRNA基因片段的引物Table1Primersamplifying16srRNAgenefragments引物名称a序列(5’-3')bPCR产物大小(bp)PCR产物的用途
权利要求
,其特征在于,包括用于扩增细菌的16SrRNA基因片段的一对引物250F:CCTACGGGAGGCAGCAGT;1020R:CGGGACTTAACCCAACAT;以及固定有如下所示序列探针中的一种或几种的***纤维素薄膜条,所述探针序列如下大肠埃希菌检测探针TCCACGGAAGTTTTCAGAGATGAGAATGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACA肠道沙门菌检测探针TCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACA粘质沙雷菌检测探针TCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACA阴沟肠杆菌检测探针TCCAGAGAACTTAGCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACA奇异变形杆菌检测探针TCCAGCGAATCCTTTAGAGATAGAGGAGTGCCTTCGGGAACGCTGAGACA铜绿假单胞菌检测探针TGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACA鲍曼不动杆菌检测探针TACTAGAAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAATCTAGATACA枯草芽孢杆菌检测探针TCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACA溶血性葡萄球菌检测探针TCCTTTGACCCTTCTAGAGATAGAAGTTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGA
金黄色葡萄球菌检测探针TCCTTTGACAACTCTAGAGATAGAGCCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGA0
,其特征在于,所述的引物1020R的5’端被生物素标记。
,其特征在于,所述的***纤维素薄膜条还固定有无序的核酸探针ATCTGATGCTGCATACGTACTGCATCCGTAACTGCAATGGTACTGTAGCC细菌通用探针TGTCGTCAGCTCGTGYYGTGARRTGTYGGSTTAAGTSCCRYAACGAGCGC0
,其特征在于,根据权利要求1所述的膜条,其特征在于,所述的细菌包括大肠埃希菌,肠道沙门菌,粘质沙雷菌,阴沟肠杆菌,奇异变形杆菌,铜绿假单胞菌,鲍曼不动杆菌,枯草芽孢杆菌,溶血性葡萄球菌,金黄色葡萄球菌中的一种或几种。
,其特征在于,250F:CCTACGGGAGGCAGCAGT;1020R:CGGGACTTAACCCAACAT。
全文摘要
本发明公开了一种用于多种细菌的基因检测膜条及其引物。选取10种常见细菌为检测对象,以16SrRNA基因为检测靶基因,设计10种常见细菌的检测探针及其配套引物。用***纤维素薄膜条作为固定探针的基质,制成10种常见细菌的基因检测膜条。
PCR扩增细菌的16SrRNA基因片段,生物素标记。PCR扩增片段与膜条杂交后,采用碱性磷酸酶标记的链亲和素检测生物素标记,然后NBT/BCIP显色。结果表明该膜条能单独检测10种细菌中的任何一种或几种。本发明成功研制了10种常见细菌的基因检测膜条,建立了用膜条检测细菌的方法,该方法具备高通量、快速、准确、成本较低的特点,并具有良好的临床应用前景。