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专利名称:用于在植物中表达异源核苷酸序列的组合物和方法
技术领域:
本发明涉及植物分子生物学领域,更具体地涉及在植物中鉴定和使用调节元件。
背景技术:
植物中叶绿体的生物发生取决于位于叶绿体与细胞核中的两个独立的遗传系统的协调的活动(参见Cline和Henry(1996),,1-26)。大量的组分叶绿体蛋白是由核基因编码的并且是细胞质合成的-作为包含称为转运肽的N-端延伸的前体形式。转运肽在特异性识别叶绿体表面并且介导前蛋白质翻译后转运跨过叶绿体被膜并且因此进入叶绿体内的各种不同亚区室(例如,基质、类囊体以及类囊体膜)的方面起作用。所报告的在其N端具有自然编码的转运肽序列的基因包括核***糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCo)的叶绿体小亚基(deCastroSilvaFilho等人(1996)-780;Schnell,(1991)(5):3335_3342);5-烯醇***莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等人(1990)(6)789-810);色氨酸合酶(Zhao,(1995)(11):6081_6087)
;质体蓝素(Lawrence等人(1997)(33):20357_20363);分支酸合酶(Schmidt等人(1993)(36):27477_27457);以及捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)-14999),虽然并不是所有这些序列在高等植物中在叶绿体靶向蛋白的异源表达中是有用的。发明概述在此提供了用于植物中多肽的叶绿体靶向的组合物和方法。组合物包含表达盒,所述表达盒包含可操作地连接到感兴趣的核苷酸序列上的对从藻类生物衍生的叶绿体靶向肽(或叶绿体转运肽,“CTP”)序列进行编码的核苷酸序列。这些表达构建体对于单子叶植物或双子叶植物中感兴趣的核苷酸序列的表达以及正确的靶向是有用的。本发明进一步提供了包含表达盒的载体、以及具有已稳定地掺入或瞬时表达在其基因组中的上述表达盒的植物和植物细胞。另外,组合物包括此类植物的转基因种子。还提供了用于在植物或植物细胞中表达核苷酸序列的方法,以及鉴定用于植物的藻类CTP序列的方法。
图1表示TagGFP在烟草原生质体中的表达。图2表示在玉米细胞中衣藻(Chlamydomonas)EPSPS叶绿体转运肽的表达以及加工。泳道1非转基因玉米系Hi-II;泳道2-6用衣藻EPSPSCTP/GRG23(ace3)(R173K)构建体转化的各个T。转植项;泳道7蛋白分子量标准标记物;泳道8纯化的
GRG23(ace3)(R173K)蛋白(4ng)。图3表示玉米中表达的经加工的衣藻EPSPS-GRG-23(ace3)(R173K)蛋白的分子量的计算。使用对数分子量对来自图2的蛋白分子量标准品的迁移距离的图的线性回归来计算GRG23(ace3)(R173K)蛋白标准品以及植物提取物中检测到的经加工的衣藻EPSPS-GRG-23(ace3)(R173K)的表观分子量。详细说明在生产转基因植物中,将外源蛋白导向至特定的亚细胞位置(例如,叶绿体、液泡、线粒体或ER)通常是有用的。以前的工作人员已经将来自不同植物基因的编码转运肽的DNA序列融合到感兴趣的基因上。当翻译该基因时,得到的蛋白质具有融合到感兴趣的蛋白质的氨基末端上的植物转运肽,并且因此以不同的效率将该蛋白质导向至所希望的亚细胞的区室。因此,本发明是针对用于在高等植物或植物细胞中多肽的叶绿体靶向的组合物以及方法。本发明的组合物包含表达盒,所述表达盒包含可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列上的对从藻类生物衍生的叶绿体转运肽(CTP)进行编码的核苷酸序列。在一个实施方案中,该CTP是从衣藻衍生的。在另一个实施方案中,该CTP包含SEQIDN0:3、5或7中所列出的氨基酸序列或由SEQIDNO:1、2、4或6所编码的氨基酸序列,及其变体、片段以及衍生物。此外,提供了转化的植物、植物细胞和种子。当在DNA构建体中进行组装从而将编码CTP的序列可操作地连接到感兴趣的核苷酸序列上时,本发明的编码
CTP的序列有助于将感兴趣的肽共翻译地或翻译后地转运到用该DNA构建体稳定转化的植物细胞的叶绿体中。在植物中用于表达核苷酸序列的方法包括将表达盒引入植物细胞中(该表达盒包含可操作地连接到感兴趣的核苷酸序列上的本发明的编码CTP的核苷酸序列)并且从该植物细胞再生转化的植物。在这里使用冠词“一个”以及“一种”是指一个或一个以上(即至少一个)的该冠词的语法对象。例如,“一个元件”是指一个或多个元件。如在此使用的,术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如,cDNA或基因组DNA)以及RNA分子(例如,mRNA)以及使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA类似物。所述核酸分子可以是单链的或双链的,但优选地是双链的DNA。叶绿体转运肽叶绿体是在进行光合作用的植物细胞以及真核藻类中发现的细胞器。叶绿体是由三个膜组成的复杂的细胞器,即内被膜、外被膜、以及类囊体膜。这些膜一起封闭了三个水性区室称为中间部、基质、以及类囊体腔。虽然叶绿体包含其自己的环形基因组,许多组分叶绿体蛋白是由核基因编码的并且是细胞质合成的,作为包含称为叶绿体转运肽(CTP)的N-端延伸的前体形式。该CTP在特异性识别叶绿体表面并且介导前蛋白质翻译后转运跨过叶绿体被膜并且进入叶绿体内的多种不同亚区室中(例如,基质、类囊体以及类囊体膜)的方面起作用。已经在叶绿体转运肽中鉴定出了至少两个独特的功能域基质靶向结构域
(stromaltargetingdomain;STD)以及内腔革巴向结构域(lumentargetingdomain;LTD)。STD控制进入普通的导入途径并且对于将过客蛋白(passengerprotein)导入到基质中不但是必要的而且是充分的。基质蛋白前体具有转运肽,这些转运肽仅包含STD,然而类囊体内腔蛋白前体具有STD和LTD两者。STD长度范围从约30个残基至120个残基,并且富含羟基化的残基并且缺少酸性残基。它们倾向于共享几种组成性基序缺少Gly、Pro以及带电荷的残基的10至15个残基的氨基末端;富含Ser、Thr,Lys以及Arg的可变的中间区;以及具有用于蛋白酶解加工的宽松地保守的序列(Ile/Val-X-Ala/Cys-Ala;SEQIDNO17)的邻近羧基的区域。然而,既不存在广泛的序列保守的嵌段,也没有任何保守的二级结构基序。理论分析表明STD主要地采用了无规卷曲的构象。所报告的在其N端具有自然编码的转运肽序列的基因包括核***糖-1,5-二磷酸羧化酶的叶绿体小亚基(RuBisCo)(deCastroSilvaFilho等人(1996)-780;Schnell,(1991)(5):3335_3342);5-烯醇***莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等人(1990)(6)789-810);色氨酸合酶(Zhao,(1995)(11):6081_6087);质体蓝素(Lawrence等人(1997)(33):20357_20363);分支酸合酶
(Schmidt等人(1993)(36):27477_27457);以及捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)-14999)。虽然已经描述了一些CTP,仅有几个已经被成功地用于试图在高等植物中将嵌合分子靶向到叶绿体中。本发明披露了从藻类物种特别是衣藻衍生的CTP在高等植物中的用途。为了本发明的目的,“高等植物”被认为是有胚植物(Embryophytae)亚界的成员。在一个实施方案中,在此处披露的方法以及组合物中有用的CTP是从衣藻中衍生的。在另一实施方案中,该CTP被列于SEQIDNO:3、5或7中或由SEQIDNO:1、2、4或6所编码,包括及其变体、片段以及衍生物。然而,本领域普通技术人员应当了解如何鉴别除了在此披露的那些肽之外的叶绿体转运肽。例如,许多CTP(或包含CTP的蛋白序列)被列于GENBANK中。在此披露的CTP对于将多肽靶向到植物细胞的叶绿体中是有用的。在一个实施方案中,与从例如高等植物生物中衍生的CTP相比,在此披露的CTP提供了改进的转运。当与参照CTP相比较时,在此披露的CTP可以导致多肽转运到叶绿体中至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约100%或更多或至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或更多的提高。能够以得以转移进入叶绿体中的多肽的量,得以转移进入叶绿体中的活性多肽的量或这两者的方式测量提高
值。也能够以用感兴趣的叶绿体靶向的蛋白转化的生物的表型方面的提高量的方式测量提高。例如,当使用本发明的CTP来将除草剂抗性蛋白靶向到植物的叶绿体中时,能够以除草剂抗性方面提高的方式测量活性的提高。表达盒可以将本发明的编码CTP的序列提供于表达盒中,该表达盒允许它来驱动由感兴趣的核苷酸序列所编码的多肽表达并定位于植物细胞的叶绿体中。“表达盒”是指DNA构建体,该DNA构建体能够导致蛋白在细胞中从可读框进行表达。该盒在转录的5'-3'方向包括转录起始区,所述转录起始区优选地包含适合用于在感兴趣的植物细胞中表达的启动子,其可操作地连接到本发明的编码CTP的序列上,它被进一步可操作地连接到感兴趣的核苷酸序列上;以及在植物中有功能的翻译和转录终止区(即,终止区)。可以通过如在此其他地方所讨论的对一个或多个“接头”氨基酸进行编码的核苷酸序列将编码CTP的核苷酸序列与感兴趣的核苷酸序列彼此分离。该盒可以另外包含至少一个另外的有待共转化入生物体内的基因,例如选择性标记基因。作为替代方案,可以将一个或多个另外的基因提供于多个表达盒上。将多个限制性位点提供于这类表达盒以用于将感兴趣的核苷酸序列插入在这些调节区的转录调节之下。该表达盒可以进一步包含一个或多个3'和/或5'非翻译区。“3'非翻译区”是指位于编码序列的下游的核苷酸序列。聚腺苷酸化信号序列以及对能够影响聚腺苷酸束加
入到该mRNA前体的3'端上的调节信号进行编码的其他序列是3'非翻译区。“5'非翻译区”是指位于编码序列的上游的核苷酸序列。其它上游或下游的非翻译元件包括增强子。增强子是发挥作用以增加启动子区域的表达的核苷酸序列。增强子在本领域中是熟知的并且包括但不限于SV40增强子区以及35S增强子元件。终止区可以是与本发明的编码CTP的核苷酸序列固有的,可以是与感兴趣的核苷酸序列固有的,或可以是从另一种来源衍生的。方便的终止区可以从根癌农杆菌()的Ti质粒得到,例如章鱼碱合酶终止区和胭脂氨酸合酶终止区。也参见Guerineau等人(1991):141_144;Proudfoot(1991)Cell64:671_674;Sanfacon等人(1991):141_149;Mogen等人(1990)PlantCell2:1261_1272;Munroe等人(1990)Gene91:151_158;Ballas等人(1989)-7903;以及Joshi等人(1987):9627_9639。在此描述的表达盒可以进一步包含除了CTP以及本领域已知的另外的CTP以外的一个或多个调节元件。“调节元件”或“调节区”是指在基因的上游或下游处所发现的核酸的一部分,它可以包含DNA或RNA,或DNA和RNA两者以及在基因表达中所涉及的物质。调节元件可以能够介导器官特异性或控制发展的或暂时的基因活化并且包括启动子元件、核
心启动子元件、应答于外部刺激可诱导的元件、被组成型地激活的元件、转录终止子、聚腺苷酸化信号、以及减少或增加启动子活性的元件(对应地例如负调节元件或转录增强子)。“顺式作用”是指物理地与转录序列邻接的序列。顺式作用序列一般地与蛋白或其他分子相互作用以实现(开/关、调节、调制等)转录。“转录增强子”是指核酸序列,当置于启动子附近并且存在于能够支持转录的转录介质中时,与在缺少该增强子下该启动子得到的结果相比该核酸序列提供增加的转录活性。增强子可以在基因的上游、之中或下游,甚至距离该转录起始位点远达50千碱基处起作用。增强子还可以独立于它们的方向起作用。“转录终止子”是指包括对减少或消除转录必需的核苷酸碱基对序列的DNA序列。“聚腺苷酸化信号”是指控制转录和翻译终止的序列。本发明的一个方面,对给定的多肽设计了合成的DNA序列,该多肽例如在此披露的方法中有用的靶向叶绿体的多肽。在细胞中该合成的DNA序列的可读框的表达导致该多肽的生成。合成的DNA序列对于简单地去除不想要的限制性内切核酸酶识别位点、对于有利于DNA克隆策略、对于改变或去除任何潜在的密码子偏爱、对于改变或改进GC含量、对于去除或改变可替代的阅读框、和/或对于改变或去除内含子/外显子剪接识别位点、聚腺苷酸化位点、SD
序列、不想要的启动子元件以及在天然DNA序列中可能存在的序列可能是有用的。还可能的是可以使用合成的DNA序列来将其他改进引入DNA序列中,例如引入内含子序列、生成作为与细胞器靶向序列(例如叶绿体转运肽、质外体/液泡靶向肽或导致生成的肽在内质网中滞留的肽序列)的蛋白融合物表达的DNA序列。合成基因还可以使用宿主细胞优选的用于提高表达的密码子来合成或可以使用密码子在宿主优选的密码子使用频率下合成。参见,例如Campbell和Gowri(1990):1_11;美国专利号6,320,100;6,075,185;5,380,831;以及5,436,391,美国公开申请号20040005600以及20010003849,以及Murray等人(1989):477_498,通过引用并入本
文作为参考。还可以将有待靶向到叶绿体的感兴趣的核酸进行优化用于在叶绿体中表达从而说明了植物细胞核与细胞器之间密码子使用方面的差异。以这种方式,可以使用叶绿体优选的密码子来合成感兴趣的核酸。参见,例如美国专利号5,380,831,将其通过引用并入本文作为参考。变体以及片段本发明还包括所披露的CTP序列的片段的核酸分子。“片段”是指该CTP序列的一部分。核苷酸序列的片段可以是生物学活性的并且因此能够有助于将感兴趣的多肽转运到植物的叶绿体中,或它可以是能够使用以下披露的方法被用作杂交探针或