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专利名称:用于制备真核表达构建体的前t载体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及T载体制备技术领域,尤其涉及一种用于制备真核表达构建体的前T载体及其制备方法和应用。
背景技术:
目前,制备真核表达构建体最常用的表达载体一般是一种带有强启动子和多克隆位点的质粒,通过双酶切获得线性载体,因此这种载体有一次获得永久使用的优点。但是,这种载体不能直接克隆PCR产物;在设计插入片段的PCR引物时如果同时考虑双酶切的酶切位点和Kozak序列那么要设计出高质量的引物就比较困难,如果不考虑Kozak序列那么有可能导致目的片段表达效率低下。这就使得使用现有的真核表达载体制备真核表达构建体的步骤较多,效率低下。
发明内容
为了克服现有的真核表达载体的一些不足,本发明提供一种用于制备真核表达构建体的前T载体及其制备方法和应用。该载体经单酶切之后形成一种真核表达T载体,不仅能直接克隆PCR产物,而且在载体上直接引入Kozak序列使得插入
片段可以高效表达并为高质量的引物设计提供很大的便利。使用该体载酶切之后形成的
T载体,只需直接将要表达的序列按照其读框设计PCR引物扩增出来,纯化后直接连接到本发明提供的T载体上,可以很大程度上简化真核表达构建体的制备过程。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是
在现有的质粒型真核表达载体中引入Kozak序列和IcM盒(或力力d盒),前者
的引入使得插入片段得以高效表达,后者的引入使得经改造过的质粒型表达载体可以很容易的通过使用Jc历I酶或其同裂酶进行酶切而获得最终的用于制备真核表达构建体的T载体。
一、前T载体
在现有的质粒型真核表达载体中引入Kozak序列和盒或^WI盒,再利用酶切或力力d酶切,形成T载体,再利用该T载体可以直接克隆PCR产物。
所述Jc历I盒或力力oT盒包括间隔DNA序列、紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个Jc历I酶切位点或J力d酶切位点序列;
所述Kozak序列位于所述Jc历I盒或力力oT盒5'端的/c/zI酶切位点或酶切位点前后20个碱基之内。
所述Xc/d酶切位点的序列是
5,CCANNNNT/丽丽TGG3,或5,CCANNNNA/NNNNTGG3,,其中
N表示A、T、G或C。
所述的^WT酶切位点的序列是
5,GACNNT/NNGTC3,或5,GACNNA/腦TC3,,其中N表示A、T、G或C。所述的Kozak序列是5'GCCRCCATGG3',其中R为嘌呤即A或G。
二、前T载体的制备方法前T载体的制备方法包括下列步骤
①制备含有Kozak序列和J^I盒的真核表达载体通用插入序列用PCR的方法扩增出一段真核表达载体通用插入序列,所述插入序列中包含
一个Zc/ffl盒、一个Kozak序列和两个兼容于现有表达载体的酶切位点;所述JcM盒包括间隔DNA序列、紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个
ZcM酶切位点序列;
所述Kozak序列位于所述XcmI盒5,端的JcM酶切位点前后20个碱基之内;所述两个兼容于表达载体的酶切位点位于所述插入片段的两翼末端,并且
使其插入表达载体后不会引起读框的改变;
②制备真核表达前T载体
将步骤①所述插入序列用所述两个兼容于表达载体的酶切位点的酶进行双酶切,同时将现有的真核表达载体用同样的酶进行双酶切,然后将所述插入片段连接到真核表达载体上,即形成用于制备真核表达构建体的前T载体;其中也可以用
J/^I替代。三、前T载体的应用
用ibM或Z^I的同裂酶酶切制备好的用于制备真核表达构建体的前T载体,即可得到可用于制备真核表达构建体的T载体。该T载体可用于直接克隆PCR产物,再利用载体上的通用引物和插入片段的特异引物通过PCR的方法就可以筛选出正向插入的单克隆。将正向插入的单克隆扩大培养提取质粒,即制备出可用于做真核表达的构建体。
本发明具有下列优点和积极效果
①所设计的用于制备真核表达构建体的前T载体是以质粒形式存在,可以通过细菌扩增而源源不断地获得;
②用A,M或的同裂酶酶切该前T载体,得到真核表达T载体,可用于直接克隆PCR产物,简化了对PCR产物和载体进行双酶切的过程;
③使用本发明提供的前T载体在设计目的片段的PCR引物时不再需要考虑酶切位点和Kozak序列,使得引物设计更加简便;
④使用本发明提供的前T载体因为载体上设计有Kozak序列故可以提高外源蛋白的表达效率。
⑤本发明提供的前T载适用于用TA克隆的方法快速制备各种真核表达构建体。
(-)/myc-hisA载体的示意图。图2是含有Kozak序列和JcM盒的真核表达载体通用插入序列示意图;
该插入片段5,端有一个起始密码子ATG,以ATG的A为坐标,其上游碱基
依次表示为-1,_2,-3……,下游碱基依次表示为+1,+2,+3……;
从-2至lj+12为一个酶切位点,用酶切后正好可以形成一个3'T
的粘性末端;
从-6到+4为一个Kozak序列;从-12到-7为一个EcoRI酶切位点;
在该插入序列的3'端依次包含一个Ic忍I酶切位点和Kpnl酶切位点。
(-)/myc-hisA的前T载体。
图4是用本发明提供方法制备的pcTANQ-GFP-myc-His质粒构建体转染
COS-7细胞后所检测到的绿色荧光。
图5是用WesternBlot方法检测插入片段及其所带标签是否正常表达;-myc-His空质粒(SampleC)和pcTANQ-GFP-myc-His质粒
(SampleE)分别转染COS-7细胞,24小时收集细胞,进行WesternBlot分析,
分别用GFP、myc和His抗体检测。
英译汉
PCR:聚合酶链式反应;
WesternBlot:免疫印迹;COS-7:非洲绿猴肾细胞-7。
具体实施例方式
下面结合附图和制备目的蛋白-myc-His标签融合蛋白表达构建体的实施例
对本发明进一步说明。
1)(-)/myc-hisA(图l)用^^RI和《/Ml进行双酶切。
2)根据某已知核酸(本实施例为e-actin的cDNA序列,)列设计这样的一对引物(图2)TANQ-F:AGAATTCGCCACCATGGCTCAATTGGCGTCCACCCGCGAGC和TANQ-R:TGGTACCAACTATTGTTTGGCAAGTTAGGTTTTGTC,该对引物的特征是其正向引物带有一个起始密码子ATG,以ATG的A为坐标,其上游碱基依次表示为-l,-2,-3……,下游碱基依次表示为+1,+2,+3……;从-2至lj+12为一个Jc/d酶切位点,其序列为CCATGGCT/CAATTGG,用Jc/z/I酶切后正好可以形成一个3'T的粘性末端;从-6到+4为一个Kozak序列;从-12到-7为一个EcoRI酶切位点;在反向引物中依次包含一个JcM酶切位点和KpnI酶切位点。
3)用该引物去扩增e-actin片段,扩增后纯化,用&oRI和^wI进行双酶切;然后连接到步骤1)(-)/myc-hisA,(-)/myc-hisA的前
T载体将其命名为pcTANQ-myc-HisA(图3),即本发明所述的用于制备真核表达构建体的前T载体。
4)用Zc/ri去切步骤3)所述前T载体得到T载体,命名为pcTANQ-myc-His-T。
5)设计引物扩增目的片段,目的片段只包含所要进行真核表达的读框序列,本实施例扩增的是GFP的完整开放阅读框,设计的引物GFP-F:ATGGTGAGCAAGGGCGAG和GFP-R:CTTGTACAGCTCGTCCATGCC。
6)将扩增的产物纯化后直接连接到步骤4)所述T载体上,即可得到所要制备的真核表达构建体,将其命名为pcTANQ-GFP-myc-His。
7)测试用该方法制备的pcTANQ-GFP-myc-His质粒构建体。将该质粒转染COS-7细胞,24小时拍荧光,结果如图5显示,GFP正常表达,说明插入片段得到了正常表达并发挥了功能;-myc-His空质粒和pcTANQ-GFP-myc-His质粒分别转让C0S-7细胞,24小时收集细胞,进行WesternBlot分析,结果显示用GFP,myc和His抗体都可以检测到特异的目的条带,分子量大小与预期的分子量一致,说明了插入片段和myc及His标签都能正常表达。这些实验数据说明带myc和His标签的GFP融合蛋白的质粒构建体已经被成功构建并可以用于做真核表达。序列表
〈110〉中国科学院水生生物研究所
〈120〉用于制备真核表达构建体的前T载体及其制备方法和应用〈140〉
〈141〉
〈160〉1
〈210〉1
〈211〉1294
〈212〉腿
〈213〉实施例中制备含有Kozak序列和义c/nl盒的真核表达载体通用插入序列权利要求
1、一种的用于制备真核表达构建体的前T载体,其特征是在现有的质粒型真核表达载体中引入Kozak序列和XcmI盒或AhdI盒,再利用XcmI酶切或AhdI酶切,形成T载体,再利用该T载体可以直接克隆PCR产物。
2、根据权利要求1所述的前T载体,其特征是-所述IctzI盒或盒包括间隔DNA序列、紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个Jc历I酶切位点或酶切位点序列;所述Kozak序列位于所述ZcM盒或盒5'端的ZcM酶切位点或屈d酶切位点前后20个碱基之内。
3、根据权利要求1所述的前T载体,其特征是所述XcM酶切位点的序列是5,CCA丽NNT/NNNNTGG3,或5,CCANNNNA/NN丽TGG3,,其中N表示A、T、G或C。
4、根据权利要求1所述的前T载体,其特征是所述的^力
Ql酶切位点的序列是5,GAC丽/NNGTC3,或5,GACNNA/NNGTC3,,其中N表示A、T、G或C。
5、根据权利要求1所述的前T载体,其特征是所述的Kozak序列是:5,GCCRCCATGG3,,其中R为嘌呤即A或G。
6、根据权利要求1所述的前T载体的制备方法,其特征是包括下列步骤①制备含有Kozak序列和IcM盒的真核表达载体通用插入序列用PCR的方法扩增出一段真核表达载体通用插入序列,所述插入序列中包含一个Xc忍I盒、一个Kozak序列和两个兼容于现有表达载体的酶切位点;所述ZcM盒包括间隔DNA序列、紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个ibM酶切位点序列;所述Kozak序列位于所述XcmI盒5'端的Jc历I酶切位点前后20个碱基之内;所述两个兼容于表达载体的酶切位点位于所述插入片段的两翼末端,并且使其插入表达载体后不会引起读框的改变;②制备真核表达前T载体将步骤①所述插入序列用所述两个兼容于表达载体的酶切位点的酶进行双酶切,同时将现有的真核表达载体用同样的酶进行双酶切,然后将所述插入片段连接到真核表达载体上,即形成用于制备真核表达构建体的前T载体;其中Jc/zI也可以用^Wt替代。
全文摘要
本发明公开了一种用于制备真核表达构建体的前T载体及其制备方法和应用,涉及T载体制备技术领域。本前T载体是在现有的质粒型真核表达载体中引入
Kozak序列和XcmI盒或AhdI盒,再利用XcmI酶切或AhdI酶切,形成T载体,再利用该T载体可以直接克隆PCR产物。本前T载体的制备方法是①制备含有Kozak序列和XcmI盒的真核表达载体通用插入序列;②制备真核表达前T载体。本发明的前T载体是以质粒形式存在,可以通过细菌扩增而源源不断地获得;可用于直接克隆PCR产物,简化了对PCR产物和载体进行双酶切的过程;使得引物设计更加简便;可以提高外源蛋白的表达效率;适用于用TA克隆的方法快速制备各种真核表达构建体。