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用于兰州百合遗传转化和种球快繁的tTCL离体再生技术的制作方法
本发明涉及一种用于兰州百合遗传转化和种球快繁的tTCL离体再生技术,外植体经消毒处理后,鳞片周围切去1mm并横切为厚1-2mm的弯月形切片,顶芽横切成3-4mm圆形切片,接种于BA/NAA比值较大的诱导培养基中,外植体均未经愈伤组织阶段而直接诱导形成小鳞茎,诱导培养4周后,提高培养基中BA和NAA的浓度,且降低BA/NAA比值,扩繁培养2代后,培养基中停止添加BA和NAA,且加倍蔗糖含量,将小鳞茎转入生根培养基中诱导生根。本发明以鳞片和顶芽为外植体,且采用tTCL的切割培养方式,诱导途径单一,出苗整齐一致,相比传统块状接种方式,在诱导时间上缩短4-5天,诱导系数提高14-17倍,是基因转化和种球快繁高效稳定的再生体系。
【专利说明】用于兰州百合遗传转化和种球快繁的tTCL离体再生技术
【技术领域】
[0001]本发明属于球根花卉组织培养和遗传育种领域,尤其涉及用于兰州百合遗传转化和种球繁育的tTCL离体再生技术。
【背景技术】
[0002]兰州百合{LiIiumdavidiivarunicolor)为百合科百合属多年生球根花丼,是川百合的一个变种。地下鳞茎个大色白,经多年栽培直径可达10-15cm,其鳞片紧密,肉质瓣厚,粗纤维少,内含丰富的蛋白质、淀粉、糖等营养物质,丰润、味醇香甜,采收其鳞茎部分作为食用,有丰富的营养价值和药用保健功效,是我国原产且栽培历史悠久的优良百合类型。其花瓣反卷、花色橙红,观赏价值高,而且植株抗旱性、抗逆性和耐盐碱性均较强,是育种中培育新种质的良好材料。
[0003]20世纪70年代起,植物细胞薄层培养技术(thincelllayers,TCL)起源并迅速发展,目前已成功应用于观赏植物的组培快繁中。TCL系统原意是从外植体上撕下厚3-6层细胞(包括表皮细胞、形成层细胞及薄壁细胞),如今薄层培养也指将外植体横切为厚约1-5_薄片的培养,即tTCL(transverseTCL)。对植物生长发育调控机制与分子机制等研究有深远意义。迄今已成功用于烟草、水稻、龙胆等植物快繁中,并在菊花、兰花、月季等观赏植物中取得不同程度的研究进展。
[0004]长期以来,兰州百合生产过程中种球退化现象严重,表现为鳞茎变小,子鳞茎数量增多,建立高效的种球快繁体系进行种球更新与复壮成为兰州百合生产的关键技术环节。过多的无性繁殖导致有性繁殖功能不同程度地退化,且若仅依赖于
常规杂交育种手段,因杂交亲本遗传背景较为单一,品种改良进程与效果受到局限。虽然近年来百合的组织培养和遗传转化研究取得了一些进展,但因受基因型的限制,目前尚未建立完善的基于基因转化和种球繁育的百合高频再生体系。而前人研究发现,采用使所有细胞都接触到筛选培养基的薄层细胞培养方法,不仅能大幅`度增加与农杆菌接触的表面积,而且可避免转化细胞嵌合体的出现。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种用于兰州百合遗传转化和种球快繁的tTCL离体再生技术,采用tTCL(薄层培养)方式,以兰州百合鳞片、顶芽为试材,选择合适的培养基,诱导小鳞茎直接分化,从而避免愈伤组织诱导,降低变异频率,缩短种球繁育周期,减少成本,为百合转基因育种提供如提和基础。
[0006]本发明提供的技术方案,包括以下工艺步骤:
:取生长健壮、无病虫害,周径12-14cm的兰州百合鳞茎,由外向内剥取鳞片、顶芽,洗衣粉水浸泡半小时,清水洗去表面泥沙,在自来水下流水冲洗12小时后备用;在超净工作台上,先用浓度75%酒精灭菌60秒,%的次***酸钠溶液浸泡15分钟,期间不断进行摇动,最后用无菌水冲洗6次,每次不少于3分钟;:
将步骤I所得的无菌外植体置于无菌滤纸上滤干水分,沿鳞片周围切去1mm,随后横切为厚l_2mm弯月形切片,顶芽横切成3_4mm圆形切片;且鳞片和顶芽薄层均含有完整的外表皮细胞。
[0007]:将步骤2所得的鳞片和顶芽薄层平铺于含诱导培养基MS+BA+NAA的培养皿中,并用无菌镊子按压外植体,使一半厚度的外植体插入培养基中;
:培养室温度为25±1°C,每天16小时光照,8小时黑暗,-—1;所有小鳞茎均由鳞片和顶芽薄层直接诱导所得,而未经愈伤组织和不定芽阶段;
:诱导培养4周后,需提高培养基中BA和NAA的浓度,且降低BA/NAA比值,以利于小鳞茎扩繁;诱导形成的小鳞茎需按单个切下,且底部带有2mm长接种的原鳞片
薄层;
:扩繁培养2代后,培养基中停止添加BA和NAA,且加倍蔗糖含量,以利于小鳞茎膨大。随后将小鳞茎转入生根培养基中诱导生根。
[0008]所述的培养皿直径为9cm,含培养基体积为20mL。
[0009]所述的MS固体培养基含有蔗糖308*1^,琼脂(条)—1,,121°C高压灭菌20分钟。
[0010]所述的小鳞茎诱导培养基含BA和NAA,BA的浓度为
-.?--1,即BA/NAA比值较大为宜。
[0011]所述的小鳞茎扩繁培养基需提高BA浓度且降低BA/NAA比值,最适培养基为MS+BA
-1+-1。
[0012]所述的小鳞茎膨大培养基为MS+-1。
[0013]所述的小鳞茎生根培养基为MS+IBA/-'
[0014]本发明的积极效果:,且采用tTCL的切割培养方式,不仅节省试验材料,降低成本,而且取材不受季节限制,尤其适合兰州百合等野生百合种质资源保存及利用;,鳞片在接种近一周时,由白色逐渐变为嫩绿色,10天左右时切面出现黄白色芽点,接种三周时,芽点逐渐膨大分化为小鳞茎;顶芽在接种一周后,首先呈横向生长,继而在节点和节间处均诱导产生小鳞茎;无需经过诱导愈伤组织或者不定芽环节,诱导途径单一,保证出苗整齐一致,便于工厂化生产;,本发明在诱导时间上可缩短4-5天,且诱导系数提高近14-17倍,可作为种球快繁高效稳定的再生体系;另外,外植体对常用抗生素敏感性强,适合作为兰州百合遗传转化的良好受体系统。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是鳞片薄层接种情况。
[0016]图2是鳞片薄层诱导形成的小鳞茎。
[0017]图3是顶芽薄层诱导形成的小鳞茎I。
[0018]图4是顶芽薄层诱导形成的小鳞茎2。
[0019]图5是小鳞茎扩繁。
[0020]图6是生根小鳞茎。【具体实施方式】
[0021]为了更详细叙述本发明的工艺步骤和技术特征,下面结合图1-6举实例说明。
[0022][实例一、兰州百合tTCL离体再生技术
兰州百合davidiivarw/?ico7or)由中国甘肃省兰州市七里河区原品百合种植加工基地提供。
[0023]:取生长健壮、无病虫害,周径12-14cm的兰州百合鳞莖,由外向内剥取鳞片、顶芽,洗衣粉水浸泡半小时,清水洗去表面泥沙,在自来水下流水冲洗12小时后备用;
在超净工作台上,先用浓度75%酒精灭菌60秒,%的次***酸钠溶液浸泡15分钟,期间不断进行摇动,最后用无菌水冲洗6次,每次不少于3分钟;
:将步骤I所得的无菌外植体置于无菌滤纸上滤干水分,沿鳞片周围切去Imm,随后横切为厚1-2mm弯月形切片,顶芽横切成3_4mm圆形切片;且鳞片和顶芽薄层均含有完整的外表皮细胞;
:将步骤2所得的鳞片和顶芽薄层平铺于含诱导培养基MS+BA(-—1)+NAA(--1)的培养皿中,培养皿直径为9cm,含培养基体积为20mL。外植体分别接种于12种含有不同浓度BA和NAA的培养基中(表1-1),其中蔗糖含量为30g.!/1,琼脂(条)含量7g.!/1。每处理接种外植体数不少于30个,并用无菌镊子按压外植体,使一半厚度的外植体插入培养基中;插入过深或过浅易引起外植体褐化、干枯,诱导效果差。
[0024]上述的基本培养基为MS固体培养基(MurashigeandSkoog,1962),—1,琼脂(条)—1,
[0025]:培养室温度为25土1°C,每天16小时光照,8小时黑暗,
[0026]鳞片在接种近一周时,由白色逐渐变为嫩绿色,10天左右时切面出现黄白色芽点,接种三周时,芽点逐渐膨大分化为小鳞茎;顶芽在接种一周后,首先呈横向生长,继而在节点和节间处均诱导产生小鳞茎;所有小鳞茎均由鳞片和顶芽薄层直接诱导所得,而未经愈伤组织阶段。其中诱导培养基含有较高浓度BA和较低浓度NAA,--1,--1,即BA/NAA比值较大时,最适合小鳞茎诱导;
接种45天后调查统计小鳞茎诱导率、诱导系数及直径。
【权利要求】
,其特征是包括以下工艺步骤:(:取生长健壮、无病虫害,周径12-14Cm的兰州百合鳞茎,由外向内剥取鳞片、顶芽,洗衣粉水浸泡半小时,清水洗去表面泥沙,在自来水下流水冲洗12小时后备用;在超净工作台上,先用浓度75%酒精灭菌60秒,%的次***酸钠溶液浸泡15分钟,期间不断进行摇动,最后用无菌水冲洗6次,每次不少于3分钟;(2).薄层培养切割:将步骤(1)所得的无菌外植体置于无菌滤纸上滤干水分,沿鳞片周围切去Imm,随后横切为厚1-2mm弯月形切片,顶芽横切成3_4mm圆形切片;且鳞片和顶芽薄层均含有完整的外表皮细胞;(3).接种:将步骤(2)所得的鳞片和顶芽薄层平铺于含诱导培养基MS+BA+NAA的培养皿中,并用无菌镊子按压外植体,使一半厚度的外植体插入培养基中;(4).小鳞茎诱导:培养室温度为25土1°C,每天16小时光照,8小时黑暗,—1;所有小鳞茎均由鳞片和顶芽薄层直接诱导所得,而未经愈伤组织阶段;(5).小鳞茎扩繁:诱导培养4周后,需提高培养基中BA和NAA的浓度,且降低BA/NAA比值,以利于小鳞茎扩繁;诱导形成的小鳞茎需按单个切下,且底部带有2mm长接种的原鳞片薄层;(6).
小鳞茎膨大及生根:扩繁培养2代后,培养基中停止添加BA和NAA,且加倍蔗糖含量,以利于小鳞茎膨大;随后将小鳞茎转入生根培养基中诱导生根。
,其特征是培养皿直径为9cm,含培养基体积为20mL。
,,,121°C高压灭菌20分钟。
,其特征是小鳞茎诱导培养基含BA和NAA,--1,--1,即BA/NAA比值较大。
,其特征是用于小鳞茎扩繁的培养基需提高BA浓度且降低BA/NAA比值,最适培养基为MS+-1+-1。
,其特征是小鳞茎膨大培养基为MS+'
,其特征是小鳞茎生根培养基为
MS+IBA/-'