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专利名称::用于产生4-羟基-l-异亮氨酸的方法
技术领域:
:本发明涉及微生物工业,并具体涉及新的双加氧酶和制备4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法。
背景技术:
:4-羟基-L-异亮氨酸是能够从胡卢巴(fenugreek)种子(豆科胡卢巴(7Hgcwe〃"/oewMm-graecww丄./egww/waae))4是取禾口纟屯^f匕的一种氨基酉交。4-羟基-L-异亮氨酸显示引起强烈兴趣的促胰岛素活性,因为它的刺激作用明显依赖于介质中的血浆葡萄糖浓度,正如在离体灌注的(isolatedperfUsed)大鼠胰脏和人胰岛中所证明的(Sauvaire,,Diabetes,47:206-210,(1998》。对于磺酰脲未确认这种葡萄糖依赖性(Drucker,.,Diabetes47:159-169,(1998)),磺酰脲是目前用于治疗II型糖尿病[或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDD或NIDDM)(non-insulin-dependentdiabetes(NIDD)mellitus(NIDDM))]的唯一促胰岛素药物,因此低血糖仍是磺酰脲治疗的一个普遍的、不理想的副作用(Jackson,,,22:211—245;295-320,(1981);Jennings,,DiabetesCare:12:203-208,(1989))。葡萄糖耐受的改善也是已知的
(.:,E463-E471,2004)。已经报道了这种葡糖代谢增强活性,和它用于药物和保健食品的潜在应用(特开平6-157302,US2007-000463A1)。仅存在于植物中的4-幾基-L-异亮氨酸,由于它的特殊似l夷岛素作用,可能被认为是新的促分泌素,对于治疗II型糖尿病具有潜在的重要性,所述II型糖尿病是一种特征在于与不同程度胰岛素抗性相关的缺陷性胰岛素分泌的疾病(Broca,,():E617画E623,(1999》。一种通过利用胡卢巴^是取物中的双加氧酶活性将4^、抗坏血酸、2-***戊二酸(2-oxyglutaricacid)和氧依赖性异亮氨酸氧化的方法,作为制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法已有报道(Phytochemistry,,,-566,1997)。然而,这种方法作为制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法并不令人满意,因为在20mM及以上的异亮氨酸浓度,所述酶的活性受到底物的抑制,该酶尚未得到鉴定,该酶源自植物提取物并且不易大量获得,并且该酶不稳定。已经公开了一种有效的光学纯(opticallypure)pS^R,4S)"4-羟基异亮氨酸的八步合成,其总产率为39%。这种合成的关键步骤涉及用白地霉(GeoWc/7wwcaw/Wwm)将乙基2-曱基乙酰乙酸生物转化为乙基(2S,3S)-2-曱基—3-羟基—丁酸酯和不对称Strecker合成(Wang,,.,834-839(2002))。还公开了(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸的一种完全控制立体化学
(totalcontrolofstereochemistry)的简短六步化学酶促合成,最后的步骤是通过使用商业上可以获得的固定在EupergitC(E-PAC)上的青霉素酰化酶G(penicillinacylaseG)水解N-苯乙酰内酯衍生物的酶促溶解(Rolland-Fulcrand,,,Chem.,873-877(2004))。但在目前,尚未报道对任何L-异亮氨酸双加氧酶的克隆和通过使用L-异亮氨酸双加氧酶直接酶促羟化L-异亮氨酸来产生(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。至于由微生物产生异亮氨酸类似物,已报道了通过芽孢杆菌属(Sfl"〃w)细菌产生2-氨基-3-***-4-曱基戊酸(AMKP)(BioorganicChemistry,,-271(1977))。然而,没有关于源自微生物的异亮氨酸轻化酶的报道。发明概述本发明的一个目的是提供通过使用源自微生物的酶来产生4-羟基异亮氨酸(用于表示包括它的游离形式和盐形式两者,并且可称作"4HIL",下同)的方法,该方法能够以大量制备4-羟基异亮氨酸。本发明的目的包括提供具有从异亮氨酸产生4-羟基异亮氨酸的酶活性的微生物,和基于使用源自微生物的酶的羟化反应从异亮氨酸产生4-羟基异亮氨酸的方法。上述目的通过发现具有从异亮氨酸产生4-羟基异亮氨酸的酶活性的微生物来实现。本发明的一个目的是提高(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸(用于表示包括它的游离形式和盐形式两种,并且可称作"(2S,3R,4S)-4HIL",下同)
的产生,提供通过使用L-异亮氨酸双加氧酶或具有所述L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌直接酶促羟化L-异亮氨酸来制备(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法。考虑前述问题而进行了大量研究,结果,本发明的发明人从自然界分离了一种具有高水平L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌,克隆了编码该L-异亮氨酸双加氧酶的基因,并且发现了该L-异亮氨酸双加氧酶可优选用于合成期望的(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸,由此完成了本发明。也就是说,本发明的目的包括提供新的L-异亮氨酸双加氧酶和编码该L-异亮氨酸双加氧酶的DNA,以及使用该L-异亮氨酸双加氧酶产生(2S,3R,4S)-4-轻基-L-异亮氨酸的方法。上述目的通过发现本发明的新L-异亮氨酸双加氧酶而实i见。在下文中将详细描述本发明。本发明的一个目的是提供产生4-羟基异亮氨酸及其盐的方法,其包括通过如下产生4-羟基异亮氨酸的步骤在源自微生物的羟化酶存在下对异亮氨酸或其盐进行羟化反应,并从异亮氨酸产生4-羟基异亮氨酸。本发明进一步的目的是提供如上所述的产生方法,其中所述微生物是属于芽孢杆菌属的微生物。本发明进一步的目的是提供如上所述的产生方法,其中所述属于芽孢杆菌属的微生物是选自苏云金芽孢杆菌(Bo"7/wAwnV^'e"^)、地衣芽孢杆菌C6(3c/〃ws//c/zewy^m&)、3求形芽孑包才干菌(6a"7/w5s//zaen-CMS)、蜡^)犬芽孑包4干菌(Bac/〃
wscerew力和韦氏芽孑包杆菌(5ac/〃wswez77erafe;/z"wem^)的孩i生物。本发明进一步的目的是提供如上所述的产生方法,其中所述羟化反应在制备自对数生长期微生物细胞的细胞裂解物存在下进行。本发明进一步的目的是提供如上所述的产生方法,其中对L-异亮氨酸进4亍羟卩t反应。本发明进一步的目的是提供如上所述的产生方法,其中所述羟化酶是双力口氧酶。本发明进一步的目的是"l是供如上所述的产生方法,其中所述羟化酶具有以下特性(a)需要氧、Fe2+、抗坏血酸和2-***戊二酸作为辅因子,(b)最适反应pH为5-8,(c)最适反应温度为45°C或更低,(d)在50。C或更高失活,(e)受到EDTA、012+和Zn2+抑制。本发明进一步的目的是提供具有以下特性并且可以从芽孢杆菌属细菌分离的双加氧酶(a)需要氧、Fe2+、抗坏血酸和2-***戊二酸作为辅因子,(b)最适反应pH为5-8,(c)最适反应温度为45。C或更低,(d)在50。C或更高失活,(e)受到EDTA、Qj2+和Zn2+抑制,(f)如通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰***凝胶电泳测量,包含分子量为29000士2000的亚基,(g)在N末端具有SEQIDNO:5的氨基酸序列。本发明进一步的目的是提供如上所述的双加氧酶,其中所述芽孢杆菌属细菌是苏云金芽孢杆菌。本发明进一步的目的是提供选自下组的DNA:(a)包含SEQIDNo:l的核普酸序列的DNA;(b)与具有SEQIDNo:l核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA在严紧条件下杂交、并且编码具有
L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA;(c)编码包含SEQIDNo:2的氨基,列的蛋白质的DNA;(d)编码具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA,所述氨基酸序列在SEQIDNo:2的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位(inversion);和(e)编码具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA,所述氨基S^列与SEQIDNo:2的氨基S^f列是至少98%同源的。本发明进一步的目的是提供通过如下获得的重组DNA:将包含上述DNA的DNA(theDNAcontainingthesame)与载体DNA连4妄。本发明进一步的目的是提供由包含上述重组DNA的重组DNA(therecombinantDNAcontainingthesame)寿争4b的纟田月包。本发明进一步的目的是提供用于产生具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的方法,其包括在培养基中培养包含所述重组DNA的细胞,和在培养基和/或细胞中积累具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质。本发明进一步的目的是提供选自下组的蛋白质(f)包含SEQIDNo:2的氨基酸序列的蛋白质;(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质,所述氨基酸序列在SEQIDNo:2的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位;和(h)与SEQIDNo:2的氨基酸序列至少98%同源并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质。本发明进一步的目的是提供一种蛋白质,其包含
(A)具有催化通过L-异亮氨酸的羟化产生(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的反应的活性;(B)所述活性依赖于二价阳离子Fe2,并且(C)如通过SDS-PAGE测量,每个亚基的分子量是约29±。本发明进一步的目的是提供用于制备(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法,包括步骤在选自下组的至少一种L-异亮氨酸双加氧酶存在下,使L-异亮氨酸在水性溶剂(aqueoussolvent)中反应(f)包含SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基Sl^列的蛋白质,(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质,所述氨基酸序列在SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位,和(h)与SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列至少70%同源并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质;分离产生的(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。本发明进一步的目的是提供用于制备(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法,包括步骤在包含选自下组的L-异亮氨酸双加氧酶的细菌存在下,使L-异亮氨酸在水性溶剂中反应(f)包含SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列的蛋白质,(g)具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质,所述氨基酸序列在SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位,和(h)
与SEQIDNo:2、8、13、17或21的氨基酸序列至少70%同源并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质;和分离产生的(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。本发明进一步的目的是提供如上所述的方法,其中所述细菌被修饰以增强L-异亮氨酸双加氧酶的活性。本发明进一步的目的是提供如上所述的方法,其中通过增加L-异亮氨酸双加氧酶的表达来增强所述L-异亮氨酸双加氧酶的活性。本发明进一步的目的是提供如上所述的方法,其中通过修饰编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达调控序列或通过增加编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的拷贝数来增加所述L-异亮氨酸双加氧酶的表达。本发明进一步的目的是提供如上所述的方法,其中所述细菌属于埃希氏菌属(E!sc/zen'c/z/a)、j艮单月包菌属(i^ewfifcwww(3s)、才奉杆菌属(C07we6acfeWwm)、节杆菌属(^W/2ra6acfer)、曲霉属(y^/erg7'〃w力或芽孢杆菌属。本发明进一步的目的是提供如上所述的方法,其中所述细菌属于大肠杆菌(£^c/zen,c/z/aco/z〕、筒单节一干菌(^W/zroZacterw'w//ex)、谷氛酉交才奉牙干菌(Cwywe6acfen,w附g/wtomz'cwm)、3求形节4干菌(/lW/2ro6actorg7o6^/brm/力、石危石黄节4干菌(^^/^(60^07-w^/rew力、粘液节^干菌(v4rf/zra6actorv&cosM力或才古草芽孑包本发明进一步的目的是提供如上所述的方法,其中所述细菌是细菌培养物、细月包、经处理的细胞
(treatedcells)或细胞裂解物。附图简述图1显示的图示展现了菌株2-e-2的培养物中4-羟基异亮氨酸和AMKP的产生量随时间的变化。图2显示的图示展现了菌抹2-e-2的培养物中浊度的变化。图3显示的图示展现了通过使用菌林2-e-2的静息细胞观察的产生4-羟基异亮氨酸和AMKP的活性。图4显示的图示展现了多种样品的4-羟基异亮氨酸产生活性。图5显示的图示展现了菌抹2-e-2细胞裂解物的4-羟基异亮氨酸产生活性的pH依赖性。图6显示的图示展现了菌抹2-e-2细胞裂解物的4-羟基异亮氨酸产生活性的温度依赖性。图7显示的图示展现了菌抹2-e-2细胞裂解物的4-羟基异亮氨酸产生活性的温度稳定性。图8显示的图示展现了纯化酶的4-羟基异亮氨酸产生活性的pH依赖性。图9显示的图示展现了纯化酶的4-羟基异亮氨酸产生活性的温度依赖性。图IO显示的图示展现了纯化酶的4-羟基异亮氨酸产生活性的温度稳定性。图11显示本发明产生IDO的方法的流程图(flowchart)。图12显示从苏云金芽孢杆菌菌抹2-e-2纯化IDO(照片)。描绘了来自纯化步骤的蛋白质制备物的SDS-PAGE。泳道1-指示分子量的标记;2-粗制细胞裂解物;3-^L酸铵沉淀;4-SEC;5-AEC。图13显示来自苏云金芽孢杆菌菌林2-e-2的IDO的MS鉴定。图14显示苏云金芽孢杆菌(以色列血清变型(serovarisraelensis),ATCC35646)RBTH—06809ORF的推定的翻译起点。图
15显示重组pMW119-IDO(Lys,32/23)质粒的人工表达模块(module)。图16显示pMW119-IDO(Lys,23)质粒的物理图谱和克隆的包含IDO结构基因的5am//I-&cI片段的测定的DNA序列。灰色标记的调节区中的自发点突变。图17显示pMW119-IDO(Lys,32)质粒的物理图谱和克隆的包含IDO结构基因的^W7州-SacI片^殳测定的DNA序列。图18显示对应于IDO(Lys,23)、IDO(Lys,32)和RBTH—6809(5'端截短的)的结构基因的DNA比对。用灰色标记可变的位置。图19显示IDO(Lys,23)、IDO(Lys,32)和RBTH—06890ORF的蛋白质比对。用该灰色标记可变的位置。图20显示来自苏云金芽孢杆菌的IDO、来自蜡状芽孢杆菌的BC1061和来自韦氏芽孢杆菌的保守的假设蛋白的蛋白质比对。实施发明的最佳方式在本说明书中,4-羟基异亮氨酸意指选自下组的非对映异构体中的一种类型、或者两种或更多种类型的混合物(2S,3S,4S)-4-羟基异亮氨酸、(2S,3R,4R)-4-羟基异亮氨酸、(2S,3S,4R)-4-羟基异亮氨酸和(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸。4-羟基异亮氨酸优选是(2S,3R,4S)-或(2R,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸,或它们的混合物,更优选是(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸。具体而言,术语"(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸',或"(2S,3R,4S)-4HIL"可以指单一化合物或含有(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸的混合物。术语"细菌,,或"微生物"如用于本说明书中包括产酶的细菌或微生物、存在或增强了目标酶活性的这些细菌或微生物的突变体和遗传重组体等。

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