用于jc病毒抗体的测定的制作方法.docx

文档介绍：该【用于jc病毒抗体的测定的制作方法 】是由【421989820】上传分享，文档一共【30】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【用于jc病毒抗体的测定的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。用于jc病毒抗体的测定的制作方法
专利名称:用于jc病毒抗体的测定的制作方法
技术领域:
本发明涉及分析样品中JC病毒抗体的存在的方法和试剂。
背景技术:
进行性多灶性白质脑病(PML)是一种与JC病毒(JCV)接触相关的中枢神经系统(CNS)的机会性感染,据信JC病毒是一种仅在持续性免疫抑制或免疫调节条件下在人体内致病的多瘤病毒。虽然PML的发展需要存在JCV,但认为PML风险以并未彻底了解的方式与引起病毒致病的多种病毒和宿主有关因子的会聚相关(Major,"ProgressiveMultifocalLeukoencephalopathyinPatientsonImmunomodulatoryTherapies":35-47(2010)[2009年8月31日,早于印刷刊物的电子版])。所公布的报道人群中JCV感染流行的研究各种各样。该信息基于各种类型的研究,包括对病毒DNA的PCR分析和JCV抗体的检测。尽管人群中JCV流行,但即使是在有免疫抑制记录的个体中JCV感染也很少导致PML。所公布的有关JCVDNA检测的报告表明所述方法不灵敏并且在评估与JCV接触方面的用途有限,因为在JCV感染的PML患者的血浆、血清或外周血单核细胞中检测到JCVDNA的情况很少并且不一致。抗JCV抗体的检测似乎是更灵敏的JCV感染标志,然而报道的结果是变化的。在
1973年,Padgett和Walker公布了使用血细胞凝集抑制(HI)测定报道JCV血清阳性率为65-84%的研究(Padgett和Walker,"PrevalenceofantibodiesinhumanseraagainsJCvirus,anisolatefromacaseofprogressivemultifocalleukoenc印halopathy":467-70,1973)。后来使用HI测定或ELISA的JCV血清阳性率的报道值在33-91%之间变化。这些研究中的可变血清阳性率很可能是由于研究规模和人口统计数据的显著差异,并且可能最重要的是测定方法的差异。因此,期望实现可靠灵敏的确定JCV抗体存在的测定,其可例如用于评估个体是否已接触JCV。发明概述本发明涉及对经分析证实的灵敏的检测生物流体(例如血清或血浆)中JCV抗体存在的测的开发。因此,本发明涉及一种方法,所述方法包括从受试者获得生物样品(例如,血浆、血清、血液、尿或脑脊髓液(CSF));在适于样品中的JCV抗体与HPVLP结合的条件下使所述样品接触高度纯化的病毒样颗粒(HPVLP);检测样品中与HPVLP结合的JCV抗体的水平;和使检测水平与参考相关联,使得所述参考被选择为指示不大于3%的假阴性率并且与样品的其它组分,例如抗其它多瘤病毒(例如,BK病毒(BKV))的抗体的交叉反应性最低。在一些实施方案中,用来自受试者的样品处理源自对照样品或样品集的参考。在一些实施方案中,选择所述参考以使测定的假阴性率不大于
1%。在一个实施方案中,纯化HPVLP制剂中至少约10%的HPVLP中的每个HPVLP含有5个以上VPl多肽。在一个实施方案中,纯化HPVLP制剂中至少约15%、约20%、约25%、约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约80%或约90%的HPVLP中的每个HPVLP含有5个以上VPl多肽。可进行测定,使得HPVLP固定在固体基底上,例如微量滴定板或载玻片上。在一些实施方案中,HPVLP基本上由VPl病毒蛋白组成。HPVLP可进一步包含其它病毒蛋白,例如VP2或VP3的至少一种。HPVLP中的病毒蛋白可经重组得到(例如MADl株VPl)或可为天然存在的病毒蛋白(例如,源自天然存在的来源)。可使用(例如)从目前正用免疫调节药物进行治疗的受试者、考虑采用免疫调节药物进行治疗的受试者或怀疑患有进行性多灶性白质脑病(PML)的受试者获得的生物样品进行所述方法。
在一些方面,测定方法为进一步包括二次确认测定过程的两步法测定,二次确认测定过程包括使来自受试者的一部分生物样品与溶液中的HPVLP接触(用附着在固体基底的HPVLP培育样品之前),从而提供二次样品;在与初步测定所用条件相同的条件下使二次样品与HPVLP接触;检测二次样品中与HPVLP结合的JCV抗体水平;和比较二次样品中JCV抗体的检测水平和未用可溶性HPVLP预先培育的样品中JCV抗体的水平,使得与未预先培育的样品相比,二次测定样品中的检测水平降低表明样品
JCV抗体呈阳性,并且检测水平的变化低于指定百分比表明样品中不存在JCV特异性抗体。本文所述测定可用于测定从未接受用免疫调节剂进行治疗的受试者或先前已接受免疫调节剂,但不再接受用免疫调节剂进行治疗的受试者或目前正在经受用免疫调节剂进行治疗的受试者的JCV抗体的存在。本发明描述的测定中对与HPVLP结合的JCV抗体的检测可表明受试者罹患PML的风险增加。对JCV抗体的检测还可表明施用某些治疗剂,例如某些免疫调节剂时,受试者发生不良症状(例如PML发展)的风险增加,从而使受试者不为用这些试剂治疗的候选者。例如,对来自受试者的样品中的JCV抗体的检测可表明受试者不是用抗VLA-4治疗剂(例如那他珠单抗)进行治疗的候选者。在某些实施方案中,对生物样品中的JCV抗体的检测可表明受试者为用免疫调节剂(例如那他珠单抗)进行治疗的候选者,不同的是与不具有可检测JCV抗体的受试者相比,受试者在治疗期间将经受加强的监测。例如,加强的监测可包括观察不良症状,例如可能表明PML发展的症状。本发明描述的测定中检测与HPVLP结合的JCV抗体失败可表明受试者为接受用免疫调节剂(例如那他珠单抗)进行治疗的候选者,并且在一个实施方案中,对受试者进一步施用免疫调节剂。可对确定不具有JCV抗体的受试者至少每年再测试一次(例如,至少每3个月、每6个月、每9个月或每12个月一次),以确定受试者是否已产生了
JCV抗体,这可能表明受试者已感染了JCV。先前生物样品中没有可检测JCV抗体而随后在生物样品中产生JCV抗体的受试者可停止接受用免疫调节剂进行治疗。在一些实施方案中,先如鉴定为具有JCV抗体的受试者随后可在日后测试并确定不具有JCV抗体。可将这些受试者确定为接受用免疫调节剂(例如那他珠单抗)进行治疗的候选者。在一个实施方案中,可向先前经测试对JCV抗体的存在呈阳性而后来经测试对JCV抗体呈阴性的受试者施用免疫调节剂,并且与从未测试为对JCV抗体呈阳性的受试者相比经受加强的监测,例如监测可能表明PML发展的症状。本发明描述的测定可用于治疗患有免疫性疾病或病症(例如多发性硬化(MS)或克罗恩氏病(⑶))的受试者。在一个实施方案中,本文所述的测定经证实可用于MS和⑶患者,如通过显示该测定在受控试验环境(例如临床试验)中可有效检测MS和CD患者的JCV抗体所证实。另一方面,本发明涉及一种试剂盒,其包含HPVLP和至少一种用于鉴定样品(例如生物样品)中JCV抗体水平的测定的试剂。在其它方面,本发明涉及包含基本上由含有VPl的颗粒组成的HPVLP颗粒的溶液,所述含有VPl的颗粒的尺寸大于VPl五聚体的尺寸,例如含有约5、10、20、30、40、50、60、70或72个五聚体或含有约25个VPl分子、约50个VPl分子、约100个VPl分子、约150个VPl分子、约200个VPl分子、约300个VPl分子、约350
个VPl分子或约360个VPl分子。本发明描述的另一方面是一种制备HPVLP溶液的方法,所述方法包括从溶液中去除与VPl五聚体尺寸相同或更小的VPl颗粒。在一方法中,VPl多肽在细胞,例如昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达。溶解细胞,然后用核酸酶(例如benzonase核酸酶)处理细胞。通过沉淀,例如通过盐(例如,硫酸铵)沉淀去除细胞碎片,然后浓缩含有VPl的上清液并且使用渗滤,例如经由一次或两次通过膜(例如切向流过滤(TFF)膜)进一步纯化。然后通过离子交换步骤进一步纯化含有VPl颗粒Uf^BHPVLP)的溶液,并且(例如)用缓冲液进行HPVLP的洗脱。例如,可通过电泳(例如,SDS-PAGE)或质谱分析法评估VPI纯度。可通过显微镜检查,例如电子显微镜检查确认HPVLP的存在。可通过沉降速度分析超速离心法确定呈HPVLP形式的总蛋白质的百分比。在一方面,本发明描述了鉴定处于发展PML的风险的受试者的方法,例如通过从受试者获得生物样品;在适于样品中的JC病毒(JCV)抗体与HPVLP结合的条件下使生物样品与HPVLP接触;检测样品中与HPVLP结合的JCV抗体的水平;和使检测水平与参考集相关联而鉴定,其中如果检测到JCV抗体结合,则受试者罹患PML的风险增加。参考集被选择为指示约5%、为约3%、为约1%或更低的假阴性率。在另一方面,本发明描述了鉴定受试者的PML风险的方法,所述方法通过确定来自受试者,例如来自血浆、血液或血清样品的样品中抗
JCV抗体的水平;和根据样品中抗JCV抗体的水平指定受试者的风险水平来进行。受试者可能正在接受免疫调节疗法,例如抗VLA4治疗(例如那他珠单抗);或可能是接受免疫调节疗法的候选者。在一些实施方案中,受试者者可能已诊断患有免疫性疾病或病症,例如多发性硬化或克罗恩氏病。在一个实施方案中,使用一步法测定来确定抗JCV抗体的水平,而在另一个实施方案中,使用两步法测定来确定抗JCV抗体的水平。一步法测定或两步法测定可包括ELISA测定。在一个实施方案中,鉴定受试者的PML风险的方法进一步包括确定初始样品的次日样品中受试者体内抗JCV抗体的水平;比较来自次日样品中的抗JCV抗体的水平和来自初始样品的样品中的水平;和确定相比在初始样品的时间,受试者在次日摧患PML的风险是否增加。在一方面,本发明描述了一种监测受试者PML风险的方法,所述方法包括使用第一天的样品确定受试者体内抗JCV抗体的水平;在第一天时基于受试者体内抗JCV抗体的水平指定PML的风险(例如,高或中度或低风险);使用第二天的样品确定确定受试者体内抗JCV抗体的水平;在第二天时基于受试者体内抗JCV抗体的水平指定PML的风险(例如,高或中度或低风险)。如本文中所使用,“HPVLP”是主要由VPl蛋白组成的高度纯化VLP(“病毒样颗粒”)。本发明描述的“HPVLP”主要由来自多瘤病毒、JC病毒(JCV),可为天然存在的VPl或重组VPl的主要衣壳蛋白
“VP1”构成。HPVLP可由例如VPl的一个以上的五聚体亚单位、至少10个五聚体亚单位、至少20个五聚体亚单位、至少30个五聚体亚单位、至少50个五聚体亚单位、至少72个五聚体亚单位或更多个五聚体亚单位构成。HPVLP可含有呈未确定构型的VPl多肽(例如多肽可能以或可能不以五聚体组织),这种情况下HPVLP可由5个以上的VPl多肽、至少50个VPl多肽、至少150个VPl多肽、至少360个VPl多肽或更多个VPl多肽构成。HPVLP包括含有约10至24个五聚体的衣壳粒。本发明描述的HPVLP可结合抗天然存在的完整JC病毒的抗体。在一些实施方案中,HPVLP包括第二和任选第三种类型的多肽,该多肽为JC病毒的小衣壳蛋白,例如至少一个VP2或VP3多肽。VP2或VP3可为重组多肽或天然存在的多肽或自然衍生的多肽。这种“高度纯化”颗粒含有I个以上的VPl五聚体,例如至少5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、72个VPl五聚体或少于100个VPl五聚体。例如,可通过涉及
双重过滤的方法获得这种高度纯化颗粒。例如,在一个实施方案中,可通过(例如)蔗糖垫离心纯化颗粒至少两次来获得高度纯化的VLP制剂。通常,可通过使用限定的对照样品,通过其在ELISA测定中的活性鉴定HPVLP制剂。在一些情况下,这种对照样品为阴性对照和/或含有低水平JCV抗体的对照样品。除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所述领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文所述类似或等效的方法和材料可用于本发明的实践或试验中,但还是在下文描述了适合的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用整体并入。如有冲突,以本说明
书(包括定义)为准。另外,材料、方法和实例仅为说明而非旨在限制。以下附图和描述中阐明了本发明一个或多个实施方案的详情。通过这些描述和附图以及权力要求,本发明的其它特征、目标和优点将显而易见。
图1为描绘来自对其尿中的JCVDNA呈阳性(尿阳性)和对其尿中的JCVDNA呈阴性(尿阴性)的受试者的样品的HPVLPELISA的结果的图。方框表示在中心处具有中线的四分位数间距(IQR);。“+”(离群值)。*曼-惠特尼U检验(Mann-WhitneyUtest)。图2为描绘通过ELISA测量的抗JCV抗体水平与通过qPCR测量的尿JCVDNA水平(η=204)的相对比的图。开口圆表示在匹配STRATA时间点收集的尿和血清样品。闭合圆表示在不同时间点收集的样品。对于DNA试验结果低于定量水平()的样品将分类为对JCV特异性抗体呈阳性。可在确认测定中测试明显不属于这些分类之一的样品(例如,%,则说明样品含有JCV特异性抗体。在一些实施方案,仅进行确认测定。实施例4中提供了选择和验证合适切点的方法的实例。基底
任何合适的固体基底均可用于HPVLP测定形式。在一些实施方案中,基底为微量滴定板(例如,96孔板)、载玻片、珠或柱。基底可适于发色或化学发光检测法。测定通过将生物样品加至已涂覆有HPVLP的基底上进行测定并使用本领域中已知的方法进行检测。通常,使用固体基础平台,例如微量滴定板(例如,96孔板);但可使用本领域中已知的其它形式。在一些实施方案中,在测定中使用之前稀释生物样品。在某些实施方案中,测定形式为酶联免疫测定(ELISA)。广义而言,所述方法通常包括用捕捉抗原(例如HPVLP)涂覆基底,培育含有针对捕获试剂的结合抗体的样品,洗涤以去除非特异性结合物种和通过(例如)发色或化学发光测定检测结合免疫复合物。发色基底产生可目视或使用分光光度计检测和测量的有色终产物。化学发光基底产生可使用亮度计测量的光。将板用HPVLP涂覆通常包括用合适浓度(例如,Iμg/ml)的HPVLP溶液培育固体基底(例如微量滴定板的孔)过夜或指定小时数。HPVLP可包括作为唯一JCV病毒组分的VPl,或HPVLP可为异质颗粒,每个颗粒含有VP2或VP3的至少一种或每个颗粒含有VP2和VP3每种中的至少一个。涂覆HPVLP之后,洗涤板的孔。然后将基底用对于待试验样品呈抗原中性的非特异性蛋白“涂覆”。合适的涂覆材料在本领域中是已知的并且包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。在可有效允许复合物形成