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专利名称:生理时钟调控蛋白lhy在培育耐逆植物中的应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及生理时钟调控蛋白LHY在培育耐逆植物中的应用。
背景技术:
逆境胁迫下植物的基因表达谱会发生变化,对拟南芥的研究表明,约30%的基因表达量变化超过2倍(transcriptomeChangesforArabidopsisinResponsetoSalt,Osmotic,,YajunWu,Hur-SongChang,TongZhu,XunWang,,December2002,,-2141),包括如下蛋白的编码基因1)直接参与植物胁迫应答的离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(脯氨酸和甜菜碱等)合成酶;2)参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子(蛋白激酶、转录因子),如DREB类转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP(basicregion/leucinezipperraotiftranscriptionfactors)类转录因子、含有碱性螺方定-环-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇(Trpcluster)的MYB家族等。
Z7^属于MYB类DNA结合蛋白的编码基因,是植物生理时钟调控基因。植物生
理时钟调控基因调控光周期诱导的开花、胚轴的生长、子叶的运动以及气孔的开关等。Z^y与另一个基因7发明内容
本发明的目的是提供生理时钟调控蛋白LHY在培育耐逆植物中的应用。本发明提供了一种培育耐逆植物的方法,是将生理时钟调控蛋白LHY的编码基因导入植物细胞,得到耐逆植物。
所述生理时钟调控蛋白LHY是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列l所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有生理时钟调控功能的由序列1衍生的蛋白质。
来源于拟南芥的植物生理时钟调控蛋白LHY(GenBankAccessionNumberAJ006404)由645个氨基酸残基组成,见序列表的序列1,序列1中自氨基端第27位至第83位氨基酸残基是MYB类DNA结合结构域。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在所述结构域以外进行的不多于三十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
所述生理时钟调控蛋白LHY的编码基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子
1)其编码序列是序列表中序列2自5'末端第60-1997位脱氧核糖核苷酸所示
的DNA分子;
2)其核苷酸序列是序列表中的序列2所示的DNA分子;
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子;
4)与l)或2)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性,且编码所述蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在5XSSC,5XDenhardt,S溶液,,50%去离子甲酰***溶液中,在65T下杂交,然后在室温用2XSSC,%SDS,在42。,%SDS各洗膜15分钟、两次。
来源于拟南芥的植物生理时钟调控蛋白的编码基因(GenBankAccessionNumberAJ006404)由1938个脱氧核苷酸组成,为序列表的序列1自5'末端第60-1997位脱氧核糖核苷酸。
所述生理时钟调控蛋白LHY的编码基因可通过任何方法导入植物细胞内,如通过图1所示的表达载体导入植物细胞内。
所述耐逆性具体可为耐盐和/或耐旱。
本发明还保护图1所示的表达载体。
含有图1所示的表达载体的转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组菌具体可将图1所示的表达载体导入农杆菌LBA4404得到。光合作用的光采集反应(light-harvestingreactions)中的ll个基因和光合体系反应中心的
10个基因都受到生理时钟的调控。参与植物碳、氮、硫合成、代谢消耗和运输储藏途径的基因也受到生理时钟的调控,如6个参与糖分解和氧化戊糖磷酸盐路径的基因,2个参与将葡萄糖转化为三磷酸腺苷路径的基因,9个参
与氮的调节的基因,5个参与硫消化代谢的基因等。因此可以说植物生理时钟调控
基因也调控了植物细胞的糖、氮、硫等的基础代谢过程。发明人认为植物的耐逆和植物细胞基础代谢这两个生理调控过程是密切关联的。
实验表明,编码LHY蛋白基因的过量表达能增强植物对逆境,特别是旱/盐胁迫的耐逆性,表明LHY蛋白在植物耐逆机制中发挥重要作用,也证明了植物的耐逆和基础代谢这两个生理调控过程密切关联。同时LHY蛋白的过量表达还能提高植物的生物总量。将LHY蛋白应用于植物育种,培育转基因植物,可以增强植物的耐逆性和提高植物的生物总量,具有深远的理论意义及广泛的实践意义。
,但并不限定本发明。
图1为￡#}1直物表达载体物理图谱
图2为zwr转基因拟南芥在正常培养条件下的生长状况
图3为Z^F转基因拟南芥耐旱实验结果
图4为z^r转基因拟南芥耐盐实验结果
图5为^5T转基因拟南芥的PCR验证照片
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
实施例中采用的试验方法均为常规方法,参见以下文献SambrookandRussell"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(2001);Cloning:APracticalApproach,〃VolumesIandII(,ed.,1985);〃王关林、方宏筠,"植物基因工程"第二版,2002年第2版。
实施例1、植物表达载体的构建
一、LHY编码基因的获得
1、提取RNA
液氮研碎-70。C保存的拟南芥(AraZ^/opsist力a"a朋)叶片,(鼎国生物技术公司),提取总RNA。将得到的总RNA用DNase酶(Prmega,America)消化,去除残存的DNA,用分光光度计(Eppendorf公司,德国)检测样品中总RNA的浓度。
2、LHY编码基因的获得根据NCBI上的Zv77基因序列(GenBankAccessionNumberAJ006404)设计一对引物如下
LHY-S:5,-GGGATACTTTACTTGTTAGAGAGGATTTG;
LHY-A:5,-AAGATATTGATAAAAATGTGGATGT。.取5Pg总RNA,用反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)进行反转录,以得到的cDN***段为模板进行PC財广增反应。
25WPCR反应体系为:、、20mMTris-HC1()、50raMKCl、、--A、lU的Taq聚合酶(上海申能***生物技术公司)。
在PCR-热循环仪(E卯endorf公司,德国)中进行PCR循环94°C预变性5分钟;再94。C30秒,52°C30秒,72°C2分钟,共30个循环;最后72。CIO分钟。
PCR扩增后得到了约2kb的DN***段,用凝胶回收试剂盒(北京天纬时代科技有限公司)回收该片段并测序(三博远志生物技术公司)。测序结果表明,该片段大小为2044bp,核苷酸序列如序列表中的序列l所示,含有Z^堪因序列(序列l的第60位至第1997位核苷酸)。
将得到的DN***段插入质粒pUC18(GenbankAccessionL09136)的S/aI位点,得到重组质粒,将重组质粒命名为pUC18::ATLHY。
二、植物表达载体构建
1、pBI121m的构建
1)SWXI和JZoI双酶切质粒pCAMBIA2300(Genebank:AF234315),回收约780bp长的35S启动子,将其连接到经S。力I-酶切的具有相同互补末端的质粒pUC18上,得到质粒pUC18-35S。
2)历/din和Wal双酶切步骤1)得到的质粒pUC18-35S,回收
795bp小片段,与同样酶切的pBI121(Genebank:AF485783)载体骨架连接,将得到的重组质粒命名为pBI121ml。
3)5"鹏I和5"acI双酶切pBI121,将得到的含有wsA基因的1887bp片段经补平处理后插入质粒pUC18的6"鹏I位点上,得到pUC18-卵sA。
4)S鹏I和feci双酶切步骤3)得到的质粒pUC18-《mA,将得到的1895bp片段插入同样酶切的pBI121ml的载体骨架中,将得到的重组质粒命名为pBI121m。
二、植物表达载体pBI121m::ATLHY的构建勤刀I和5"鹏I双酶切质粒pUC18::ATLHY,^T基因片段,插入到同样双酶切的质粒pBI121m上,将得到的重组质粒命名为pBI121m::ATLHY,质粒pBI121m::ATLHY的结构如图1所示,基因受到启动子35S的控制,终止子为Tnos。
将pBI121m::ATLHY转入农杆菌LBA4404,得到含有pBI121m::ATLHY的农杆菌菌株,将该菌株命名为TpBI-ATLHY。
实施例2、转基因植株的获得以及转基因植株耐逆性
一、转基因植株的获得
分别用TpBI-ATLHY农杆菌侵染拟南芥"raZ)Wo戸z;y^///朋a),以获得转基因植株,具体操作如下
拟南芥按常规方法培养,培养条件为光照时间16/8小时,光照强度不低于
5000Lux,温度22摄氏度,湿度70%。
培养介质为按l:l混匀的蛭石和草炭土,每周浇一次"花无缺"营养液(每2升水加1克,上海永通化工有限公司),幼苗生长约25天后,第一个花序长到高8厘米左右时从基部掐除,再过一周时间二次抽薹,花蕾刚要露白时用农杆菌进行侵染。-,菌液4000转离心10分钟收集菌体,以等体积的5%蔗糖溶液悬浮,测其0D600值,换算后用5%,加入万分之三体积的SilwetL-77溶液,混匀后进行浸染,浸染方法采取"蘸花法",即用枪头吸取农杆菌液滴蘸花絮。遮光24小时后重新正常生长。5-6天后进行第二次侵染,共浸染3次。侵染结束后约一个月左右收种。
所得T1代种子在抗性培养基上筛选出转基因苗,方法为70%酒精表面消毒1分钟,次***酸钠溶液(5。/。次***酸钠+。/。SDS),消毒15分钟,无菌水洗涤5遍,播种于1/2MS固体培养基(加卡那霉素30mg/l+羧卞125mg/l)。4"C冰箱放置3天后置于正常培养间光照培养,十天后将抗性苗移至蛭石和草炭土的营养基质中,常规培养,两个半月后收种为T2代种子。
将用上述方法筛选得到的T2代植株的种子培育成小苗,共得到了30个株系的转^^基因拟南芥。
在正常培养条件下培养两个月,观察并拍照,见图2。图2中,左为转zwr基因拟南芥,右为野生型拟南芥。结果表明,转Z^7基因拟南芥营养生长长势明显优于野生型拟南芥,生殖生长延后。
二、耐旱试验将30个株系的转LY7基因拟南芥和未筛选的野生型拟南芥进行耐旱实验。具体方法如下
将经过卡那筛选的30个株系的转ZW7基因拟南芥和未筛选的野生型拟南芥,每个株系各7株,同时对称地移栽到同一小钵的两侧。每个株系设3个重复。常规管理,浇水3次后停止浇水,三周后复水,一周后观察并拍照。
耐旱实验例见图3。图3中,左为转Zi^基因拟南芥,右为野生型拟南芥,以白牌隔开。
实验结果显示,野生型拟南芥全部枯死,而转Z^y基因拟南芥恢复生长良好。
三、耐盐试验
将30个株系的转Z〃/基因拟南芥和未筛选的野生型拟南芥进行耐盐实验。具体方法如下
将经过筛选的30个株系的转Z^y基因拟南芥和未筛选的野生型拟南芥,每个株系各6株,同时对称地移栽到同一小钵的两侧。每个转基因株系设3个重复。第一周浇水,第二周和第三周分别浇200mM和300mM的NaCl盐水。第四周观察并拍昭。
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耐盐实验例见图4。图4中,左为转Z^7基因拟南芥,右为野生型拟南芥,以白牌隔开。
结果显示,野生型拟南芥渐渐死亡,而转z^y基因拟南芥生长虽然受到影响,
但植株仍保持绿色。
四、PCR鉴定
在步骤二和步骤三的试验中均存活的转Z^T基因株系为4个。
取这4个株系T2代植株的叶片和野生型拟南芥的叶片,用CTAB法分别提取基因组DNA(SteinerJJ,PoklembaCJ,FjellstromRG,ElliottLF.,Arapidone-;23(13):2569-70.)。分别以500ng提取的基因组DNA为模板进行PCR反应。引物如下
引物F:5'-CCCACTATCCTTCGCAAGACC(源于35s启动子序列)-3,;
引物R:5,-CATGAGAAGCCCACCAAGCA-3'。
反应体系为25W,含有500ng基因组DNA、、20mMTris-HC1()、50raMKCl、、、1U的Taq聚合酶(上海申能***生物技术公司