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罗非鱼肌浆蛋白源抗氧化肽的制备、分离纯化
及其体外抗氧化活性
胡晓1,周雅1,2,陈星星1,2,李来好1,*,杨贤庆1,陈胜军1,吴燕燕1,杨少玲1
(,农业农村部水产品加工重点研究室,广东广州510300;
,上海201306)
摘要:采用木瓜蛋白酶对罗非鱼肌肉蛋白组分(肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白)进行酶解,研究罗非
鱼不同蛋白组分酶解产物的抗氧化活性,并通过超滤、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱对高活性肌浆蛋白组
分抗氧化肽进行分离纯化,同时对纯化后的抗氧化肽氨基酸组成予以分析。结果表明:罗非鱼肌浆蛋白酶解物
(tilapiasarcoplasmicproteinhydrolysates,TSPH)抗氧化活性高于肌质与肌原纤维蛋白酶解物,当肌浆蛋白酶解
4 h时,TSPH(6 mg/mL)对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、羟自由基
清除率及其还原力均达到最高,%、%;经超滤分离后,其分子质量小于5 kDa的组分具
有较高的抗氧化活性;该组分经凝胶色谱分离后,富集得到E1~E4共4 个组分,其中E3组分(~ kDa)的
抗氧化活性最高, 3 mg/mL %,;E3组分再经反相高效液相色
谱分离纯化后,富集得到F1~F9共9个组分,其中F4组分的抗氧化活性最高,其DPPH自由基的半清除质量浓度为
mg/mL,且经氨基酸组成分析发现色氨酸(Trp)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)为其含量较高的氨基酸,
%、%%。
关键词:罗非鱼;肌浆蛋白;抗氧化肽;制备;分离纯化
Preparation,PurificationandinVitroEvaluationofAntioxidantPeptidesfromTilapia(Oreochromisniloticus)
SarcoplasmicProtein
HUXiao1,ZHOUYa1,2,CHENXingxing1,2,LILaihao1,*,YANGXianqing1,CHENShengjun1,WUYanyan1,YANGShaoling1
(,MinistryofAgricultureandRuralAffairs,SouthChinaSea
FisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Guangzhou510300,China;
,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)
Abstract:Papainwasselectedtohydrolyzethreetilapiamuscleproteins(sarcoplasmic,myofibrillarandstromaproteins)
sarcoplasmicproteinwereseparatedandpurifiedbyusingultrafiltration,gelfiltrationchromatographyandreversed-phase
highperformanceliquidchromatography(RP-HPLC),
thattheantioxidantactivityoftilapiasarcoplasmicproteinhydrolysates(TSPH)washigherthanthatofmyofibrillarand
(6mg/mL)exhibitedthehighest1,1-diphenyl-
2-picrylhydrazyl(DPPH)radicalscavengingrate(%),hydroxylradicalscavengingrate(%)andreducingpower
(),andthefractionwithmolecularmassesof
-fractions
(E1–E4)-fractionE3(–)possessedthehighestantioxidant
收稿日期:2020-01-16
基金项目:现代农业产业技术体系建设专项(CARS-46);茂名市引进创新创业团队项目(200201095834980);
广东省基础与应用基础研究基金项目(2019A1515011588);广东省自然科学基金项目(2017A030313164);
广东省科技创新战略专项资金(纵向协同管理方向)计划项目(2018S0044);
中国水产科学研究院基本科研业务费资助项目(2020TD69)
第一作者简介:胡晓(1981—)(ORCID:0000-0003-0823-0452),男,副研究员,博士,研究方向为水产品加工与质量安
全、食品生物技术。E-mail:******@
信作者简介:李来好(*通1963—)(ORCID:0000-0001-9371-9230),男,研究员,博士,研究方向为水产品加工与质量安全。
E-mail:******@
万方数据
64 2021,,※基础研究
activity,%
of3mg/,E3wasseparatedintoninefractions(F1–F9)byRP-HPLC,andF4exhibitedthehighestDPPHradical
scavengingactivitywithahalf-maximalinhibitoryconcentration(IC50)
dominatedbyTrp,GlyandHis,%,%%ofthetotalaminoacids,respectively.
Keywords:tilapia;sarcoplasmicprotein;antioxidantpeptides;preparation;purification
DOI:-6630-20200116-193
中图分类号::A文章编号:1002-6630(2021)03-0063-08
引文格式:
胡晓,周雅,陈星星,、分离纯化及其体外抗氧化活性[J].食品科学,2021,42(3):
63-:-6630-20200116-://
HUXiao,ZHOUYa,CHENXingxing,,purificationandinvitroevaluationofantioxidantpeptidesfrom
tilapia(Oreochromisniloticus)sarcoplasmicprotein[J].FoodScience,2021,42(3):63-70.(inChinesewithEnglishabstract)
DOI:-6630-20200116-://
自由基是生物体在氧化反应过程中产生的中间产值化利用程度有待进一步提高,因此研究罗非鱼肉的精
物,当自由基的产生和清除无法平衡时,过量的自由基深加工及高值化利用具有十分重要的意义[8-10]。目前,以
会破坏超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等关罗非鱼肉为原料,采用不同的蛋白酶对其水解制备抗氧
键酶类,并通过氧化细胞膜脂质、蛋白质和DNA等对化活性肽已有报道[11-13]。由于罗非鱼肉蛋白主要由肌原纤
机体组织及细胞产生严重的氧化损伤,进而导致机体衰维蛋白、肌浆蛋白与基质蛋白构成,而不同组分蛋白及
老、癌症和心血管病等各种疾病的发生[1],因此使用抗氧其酶解产物的抗氧化活性可能会存在较大差异。因此,
化剂减少机体的氧化损伤成为人们日益关注的焦点。此以罗非鱼肌肉蛋白组分为研究对象,筛选并分离富集出
外,食品中的脂质等营养物质易于氧化,会导致食品品高活性组分的蛋白源抗氧化肽,可为罗非鱼抗氧化肽的
质下降,缩短其货架期,以致于需在食品生产及储运过研究与开发提供重要依据。本研究采用木瓜蛋白酶对罗
程中添加抗氧化剂,但目前常用的人工合成抗氧化剂会非鱼肌肉蛋白组分进行酶解,比较并探讨不同组分蛋白
对人体产生一定的不良影响,甚至与癌症的发生有关[2]。其酶解产物的抗氧化活性,并通过超滤、凝胶过滤色
因此,亟需寻找安全、无毒的天然抗氧化活性物质。抗谱、反相高效液相色谱(reversed-phasehighperformance
氧化活性肽是一种具有清除体内自由基和抑制生物大分liquidchromatography,RP-HPLC)对活性较高的肌浆蛋
子过氧化作用的生物活性肽,具有较高的抗氧化活性和白源抗氧化肽进行了分离纯化,同时对其氨基酸组成予
安全性,应用前景十分广阔。以分析,旨在为罗非鱼精深加工及高值化利用提供理论
水产品中蛋白质含量高且营养丰富,已成为近年依据及参考。
来国内外制备抗氧化肽的重要原料[2-6]。从水产抗氧化
肽的相关研究结果来看,其分子质量大多主要分布在1材料与方法
300~1 500 Da之间,其肽链通常含有一个或多个疏水性
氨基酸残基(Gly、Leu、Ala、Pro等)、
酸残基(Cys、Met)、芳香族氨基酸残基(Phe、Trp、罗非鱼购于广州华润万家超市,取鱼肉,洗净沥
Tyr)以及含有咪唑环的组氨酸残基(His)。此外,多肽干,绞碎,置于聚乙烯袋中于-20℃冻藏备用。
中氨基酸的位置及序列也与其抗氧化活性有关,如碱性木瓜蛋白酶广东江门拜奥生物化学厂;1,1-二
氨基酸位于肽段的C端会使其具有更高的自由基清除能力苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,
[7]。尽管国内外对抗氧化活性肽已经开展了大量研究,但DPPH)、细胞色素c(12 400 Da)、抑肽酶
其氨基酸组成特征、构效关系以及作用机理还需进一步(6 Da)、维生素B12(1 Da)、氧化型谷
研究和验证。罗非鱼是我国大宗养殖鱼类,产量位居世胱甘肽( Da)、还原性谷胱甘肽( Da)
界首位,其肉的蛋白质质量分数可高达19%,且所含氨美国Sigma公司;邻二氮菲上海韶远化学科技有限
基酸种类齐全、比例合理,是利用生物酶解法制备功能公司;邻***广州菲博生物科技公司;三***乙酸、
性肽的理想原料来源,但目前罗非鱼肉的加工利用主要乙***、甲醇(均为色谱纯)上海安谱科学仪器有限
以冷冻罗非鱼片为主,产品的附加值较低,其蛋白质高公司;其他试剂为国产分析纯。
万方数据
※基础研究食品科学2021,, 65
:进样量为100μL,进样质量浓度为5mg/mL,
DK-S24型恒温水浴锅上海森信实验仪器厂有限公司;%三***乙酸,流动相B为乙***,流
BS224S型电子精密天平德国Sartorius公司;,柱温30℃,检测波长为215nm,梯度
精密pH计梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司;洗脱。多次重复进样收集各分离峰,旋转蒸发后冷冻干
UV2550型紫外-可见分光光度计日本岛津公司;燥测定其抗氧化活性。
均质机德国公司;酶标仪瑞士
T50IKASUNRISE将C18半制备柱分离富集得到的抗氧化活性最高的峰
公司;型高速冷冻离心机德国公司;
TECAN3K30Sigma组分用C18分析柱鉴定其纯度,色谱分离条件:洗脱液为
HH-4型数显恒温水浴锅常州澳华仪器有限公司;体积分数25%甲醇溶液, mL/min,检测波
THZ-82水浴恒温振荡器金坛精达仪器制造厂;超长为215 nm。
纯水系统、
美国公司;国美公司;
MiliporeSephadexG-25GE氨基酸组成分析按照GB/—2016《食品安
型高效液相色谱、半制备柱(×,
mm250 mm全国家标准 食品中氨基酸的测定》中的方法进行。
)、分析柱(×,)、
5 mm150 ·OH清除能力的测定
柱(×,)美国
Elicpse mm150 μm参照Jin Ming等[15]的方法并有所修改。 mL
Agilent公司。
5 mmol/L邻二氮菲的无水乙醇溶液, mL mol/L
磷酸盐缓冲液(pH ) mL mmol/L
的FeSO4溶液,加入样品溶液2 mL后充分摇匀,再加入
罗非鱼肉不同组分蛋白参照课题组前期研究的方法[14]
%的H2O2溶液混匀,37 ℃条件下水浴
进行制备。各组分蛋白的提取率为提取得到的各组分蛋
1 h,于536m n波长处测得吸光度A1;以去离子水代替样
白质量与罗非鱼肉蛋白的质量比。
品和H2O2溶液重复上述操作,测得吸光度A2;以去离子
水代替样品重复上述操作,测得吸光度A3。按公式(1)
将提取的各组分蛋白用蒸馏水(4 ℃)稀释成蛋白
计算·OH清除率。
质量分数约4%的溶液,匀浆后,将蛋白溶液pH值调节至
A1-A3
,%的木瓜蛋白酶,60 ℃·OH清除率/%=×100(1)
A-A
下恒温水浴振荡酶解1、2、4、6、8 h。酶解至终点时于23
自由基清除能力的测定
沸水中灭酶15 min,冷却后离心(10 000 r/min、4 ℃,
[16]
10 min),取上清液抽滤,滤液即为不同组分蛋白酶解液。参照Bae等的方法并稍作修改。取2 mL样品溶液,
mL mmol/L DPPH溶液(用体积分数95%的乙
将酶解液在室温下通过截留分子质量分别为10 kDa醇溶液溶解),混匀后在室温条件下避光反应30 min,
于波长处测定吸光度,对照组以体积分
与5Da k的超滤膜,收集截留液和滤过液,所得组分分别517m nA12L m
数的乙醇溶液代替溶液,于
记为TSPH-1(10 kDa以上)、TSPH-2(5~10 kDa)、95%DPPH517 nm波长处测
定吸光度,空白组为溶液加体积分数
TSPH-3(5Da k以下),将各组分冷冻干燥后配制成质量A22 mL DPPH2 mL
的乙醇溶液,于波长处测定吸光度。按公
浓度为3 mg/mL的溶液用于测定抗氧化活性。95%517 nmA3
(2)计算DPPH自由基清除率。
-
μmA1A2
DPPH自⭡基清除率/%=(1-)×100(2)
微孔滤膜过滤后,利用Sephadex G-25凝胶柱予以进一A3
步分离纯化。色谱分离条件:进样量为1L m,
量浓度为50 mg/mL,以超纯水作为洗脱液,洗脱液流速参照Markhund等[17]的方法并有所修改。 m样品
mL/min,在215 nm波长处多次重复进样收集各分溶液, mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH ),
离峰组分,冷冻干燥后测定其抗氧化活性。同时以细胞混匀后在25 ℃中水浴10 min, mL3 mmol/L的
色素c(12 400 Da)、抑肽酶(6 Da)、维生素B12邻***溶液,振荡摇匀后立即在325 nm波长处测定吸
(1 Da)、氧化型谷胱甘肽( Da)、还原性谷光度,测定时间为5 min,每30 s读数一次。 mL去
胱甘肽( Da)作为标准品,测定样品的分子质量。 m mol/L的Tris-HCl缓冲溶液( 8)
-HPLC分离调零,对照组以去离子水代替样品。作吸光度随时间变
取凝胶过滤色谱分离所得抗氧化活性最高的组分,化的回归方程,斜率即为邻***自氧化速率,按公
采用RP-HPLC C18半制备柱予以进一步分离纯化。色谱式(3)计算超氧阴离子自由基清除率。
万方数据
66 2021,,※基础研究
[14]
v1蛋白和基质蛋白酶解物。陈星星等用中性蛋白酶对
超氧阴离子自⭡基清除率/%=(1-)×100(3)
v2罗非鱼肉不同组分蛋白进行酶解,得到肌浆蛋白酶解物
自由基的半清除质量浓度(
式中:v1为样品组的邻***自氧化速率;v2为对照DPPHhalfmaximalinhibitory
组的邻***自氧化速率。concentration,IC50) mg/mL,显著低于肌原纤维蛋
( mg/mL)和基质蛋白酶解物( mg/mL)
[18]
参照Ahmadi等的方法并稍作修改。取1 mL样的IC50,这与本实验的研究结果相一致。
品液,加入1 mL mol/L的磷酸缓冲液(pH )·OH清除率
1 mL质量分数1%的铁***化钾溶液,混匀后50 ℃下水浴·OH是化学性质非常活泼的一种活性氧,在活
20 min,加入1 mL 10%的三***乙酸溶液,混匀后10 000 r/min性氧中其危害性最大,一旦与物质接触,几乎可以在
[20]
离心10 min。取1 mL上清液,加入1 mL去离子水和瞬间发生反应。·OH可以通过Fenton反应产生,
反应式为2++3++·+-,邻二氮
%的FeCl3溶液,混匀后50 ℃水浴FeH2O2→FeOHOH
菲2+会被·氧化成邻二氮菲3+,从而使
10 min,在700 nm波长处测定其吸光度,以A700 nm代表还-FeOH-Fe536 nm
原力。用去离子水代替样品作为空白对照。波长处最大吸收峰消失,当有抗氧化物存在时,抗氧化
2+3+
·OH将邻二氮菲-Fe氧化成邻二氮菲-Fe,
采用Excel软件处理数据,数据以平均值±标准差表颜色变化明显,从而能够判断出抗氧化物对·OH的抑制
[21]
示,。情况。
60基质蛋白
2结果与分析肌浆蛋白
50
肌原纤维蛋白
40
20
采用本实验的分离方法,罗非鱼肉各组分蛋白OH清除率/%
提取率的大小为:肌原纤维蛋白>肌浆蛋白>基质蛋·10
0
白。其中,基质蛋白的提取率为(±)%,12468
高于草鱼(%)等鱼类[19];肌浆蛋白的提取率为酶䀓时间/h
(±)%,高于鳙鱼(%)[19],但低于图2酶解时间对罗非鱼各组分蛋白酶解物·OH清除率的影响
鲫鱼(%)等鱼类[19];
(±)%,与鲤鱼相近(%)[19]。capacityofhydrolysatespreparedfromtilapiamuscleproteins
各组分蛋白酶解产物清除·OH的能力如图2所示,
肌浆蛋白酶解物对·OH的清除率随着酶解时间的延长先
各组分蛋白酶解物的DPPH自由基清除率如图1所
呈上升趋势,在4 h时达到最大,%;而继续延长
示,肌浆蛋白在酶解4 h时的DPPH自由基清除率达到最
酶解时间,其清除率逐步下降;基质蛋白酶解物的·OH
高,%;基质蛋白和肌原纤维蛋白酶解物对DPPH
清除率在酶解1 h时达到最高,%,随后降低;肌
自由基的清除率较为接近,均在酶解1 h时清除率达到最
原纤维蛋白酶解物对·的清除率随着酶解时间的延长
高,%%。OH
呈缓慢下降的趋势, %。
90对比种组分蛋白酶解物·的清除能力可知,清
803 OH
70除率的大小顺序为肌浆蛋白酶解物>基质蛋白酶解物>
60基质蛋白
50肌浆蛋白肌原纤维蛋白酶解物,说明采用木瓜蛋白酶酶解时,肌
40肌原纤维蛋白
30浆蛋白酶解物是罗非鱼肌肉蛋白酶解物中·OH清除能
20力最高的组分。酶解物样品的·清除率变化趋势与
10OH
DPPH自⭡基清除率/%0
12468DPPH自由基清除率结果相一致。
酶䀓时间/
图1酶解时间对罗非鱼各组分蛋白酶解物DPPH自由基清除率的影响超氧阴离子具有很强的活性,能够使多糖解聚、核
,并引发细胞膜脂质过氧化,造成线粒体氧化
hydrolysatespreparedfromtilapiamuscleproteins
磷酸化作用的改变以及膜损伤等[22-23]。生物体内的超氧
对比罗非鱼3 种组分蛋白酶解物对DPPH自由基阴离子自由基可以通过歧化反应生成H2O2,H2O2可以与
的清除率可知,肌浆蛋白酶解物明显高于肌原纤维Fe2+或Cu2+等离子生成氧化性更强的·OH。本研究
万方数据
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采用邻***自氧化法测定酶解物超氧阴离子自由基清本研究结果进一步表明罗非鱼木瓜蛋白酶水解物中高还
除率,邻***在碱性环境下自氧化可以生成超氧阴离原力组分主要来源于肌浆蛋白。
子自由基,并产生有色中间产物,当有抑制物存在时,综合上述不同酶解时间各组分蛋白酶解物的抗氧
超氧阴离子自由基被清除,有色中间产物积累减少;因化活性,本研究以抗氧化活性最高的肌浆蛋白酶解物
此,可通过检测有色中间产物的含量来评价样品的超氧(4 h)为对象,通过超滤、凝胶过滤色谱等分离技术,
阴离子自由基的清除能力。分离富集具有高活性的抗氧化肽。
25
20超氧阴离子自⭡基清除率
·OH清除率
15DPPH自⭡基清除率
10基质蛋白70A700nm
5肌原纤维蛋白50
700nm
超氧阴离子自⭡基清除率/%040
12468
酶䀓时间/h清除率/%
20
10
图3酶解时间对罗非鱼各组分蛋白酶解物超氧阴离子自由基清除率的影响
-1TSPH-2TSPH-3
组分
capacityofhydrolysatespreparedfromtilapiamuscleproteins
图5TSPH超滤组分的抗氧化活性
率如图3所示,3 种组分蛋白均在酶解2 h时具有最高的超byultrafiltration
氧阴离子自由基清除活性,其中肌浆蛋白酶解物清除活
如图5所示,超滤分离后各组分均具有一定的抗氧化
性最高,为%;基质蛋白酶解物与肌原纤维蛋白酶
,同时分子质量最小的超滤组分TSPH-3具有最高的
解物的清除活性无明显差异,%%。
抗氧化活性,其对DPPH自由基、·OH、超氧阴离子自
3 种蛋白酶解物超氧阴离子自由基清除率均在酶解1~2 h
由基的清除率及还原力最高, %、%、
快速上升,2~8 h呈现不同程度的下降趋势。从结果来[25]
%。郝更新等用超滤法对牡蛎蛋白的抗氧
看,肌浆蛋白是罗非鱼肉蛋白组分中制备高抗氧化活性
化活性肽进行了分离富集,发现分子质量小于4Da k组分
酶解产物的最适组分。
的抗氧化活性高于原液及其他超滤组分。郭善广等[26]对
不同组分蛋白酶解物的还原力
性分析,发现各组分的抗氧化活性大小顺序依次为
k
肌原纤维蛋白以下组分、5~10Da k组分、10Da k以上组分,这与本研
。但也有学者研究发现小分子质量的蛋白
700nm[27]
A肽抗氧化活性并不一定最高,张爽等研究发现鲍鱼外
~5 kDa的组分对·OH和DPPH
k的组分,说
12468
酶䀓时间/h明肽的抗氧化活性与其分子质量相关,但同时可能也会
图4酶解时间对罗非鱼各组分蛋白酶解物还原力的影响受到其氨基酸组成与序列的影响。
preparedfromtilapiamuscleproteins
选择超滤分离后抗氧化活性最高的TSPH-3组分予以
还原力能够衡量抗氧化剂供电子能力的强弱。由图4进一步的分离纯化。图6为TSPH-3的凝胶过滤分离色谱
可知,肌浆蛋白酶解物的还原力随酶解时间延长的趋势图。经凝胶过滤分离后,主要富集得到4 个组分峰,分别
与其清除DPPH自由基、·OH活