胃癌中新颖hsa circ 0003071的特征、功能及预后分析.pdf

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·论著·
胃癌中新颖hsa_circ_0003071的特征、功能及预后分析
黄伟,周新科,林铭珍,肖瑶,梁敏,姚文霞∗
(广州医科大学附属第五医院肿瘤科,广州市加速康复腹部外科重点实验室,广东广州
510700)
摘要目的:研究胃癌中环状RNAhsa_circ_0003071的基本特征、功能预测及生存预后分析。方法:
通过PCR扩增验证胃癌与癌旁组织中hsa_circ_0003071的表达量,利用PCR扩增及一代测序验证hsa_
circ_0003071反向剪接位点,利用核糖核酸酶R(RNaseR)处理,细胞质细胞核RNA分离和定量PCR以
及蛋白质翻译的潜能分析研究hsa_circ_0003071的基本特征。利用生信方法预测hsa_circ_0003071上微
RNA(miRNA)的结合位点以及miRNA的靶基因,并构建circRNA-miRNA-mRNA网络,随后利用基因本体
论(GO)及京都基因和基因组百科全书(KEGG)对miRNA的下游靶基因合集进行功能注释。结合生信方
法获得hsa_circ_0003071调控的下游关键靶基因在胃癌的生存预后分析。结果:PCR实验证实胃癌中hsa
_circ_0003071的表达量显著低于癌旁组织。CircBase注释显示hsa_circ_0003071是由基因SPATS2L转录
本NM_001100422中第6号外显子经反向剪接构成,并且PCR扩增和一代测序共同验证了hsa_circ_
0003071的反向剪接位点。hsa_circ_0003071可以抵抗RNaseR处理,并且主要分布于细胞质。蛋白质翻
译分析显示,hsa_circ_0003071具有翻译蛋白的潜能,其开放阅读框可能编码含124个氨基酸的蛋白质。
生信预测显示hsa_circ_0003071具有多个miRNA结合位点,取数据库交集的两个miRNA(has-miR-604、
has-miR-1205)预测其下游靶基因共148个,随之构建circRNA-miRNA-mRNA调控网络。GO分析结果显
示,上述靶基因合集分别在12个生物学过程条目和2个分子功能条目中显著富集;KEGG通路分析结果
显示,上述靶基因合集在mRNA监测通路和Hippo信号通路显著富集。结论:本研究分析了胃癌中新型
环状RNAhsa_circ_0003071的表达量、反向剪接位点、RNaseR酶的抵抗性和主要分布在细胞质等基本特
征,从蛋白质翻译、circRNA-miRNA-mRNA调控网络和环状RNA下游调控关键基因在胃癌中的预后生存
分析角度为hsa_circ_0003071的功能研究提供了新的方向。
关键词SPATS2L;hsa_circ_0003071;miRNA;功能预测;预后分析
中图分类号::A文章编号:2095-9664(2022)03-0021-11
Characterization,functionpredictionandprognosticroleofhsa_circ_
0003071,anovelcircularRNA,ingastriccancer
HuangWei,ZhouXinke,LinMingzhen,XiaoYao,LiangMin,YaoWenxia∗
(DepartmentofOncology,FifthAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangzhouKeyLaboratoryof
EnhancedRecoveryAfterSurgeryinAbdominalSurgery,Guangzhou510700,China)
∗Correspondingauthor:Email:******@
AbstractObjective:Toinvestigatethebasiccharacteristics,predictedfunctionsandprognosticroleofthe
:Theexpressionlevelsofhsa_circ_0003071ingastric

wasverifiedbyPCRamplificationandfirst-(RNaseR)digestion,
cytoplasmicnuclearRNAisolation,quantitativePCR,andanalysisofproteintranslationalpotentialwere

DOI:.2095-
基金项目:广州市加速康复腹部外科重点实验室项目(201905010004)
∗通讯作者:Email:******@
21:.
广州医科大学学报(JGZMU)2022,50(3)
sitesofmicroRNAs(miRNAs)-miRNA-

performedusingGeneOntology(GO)andKyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG).Thesurvivaland
prognosticroleofthekeydownstreamtargetgenesregulatedbyhsa_circ_0003071ingastriccancerwas
:PCRconfirmedthatthehsa_circ_0003071expressionlevelwas

0003071wasformedbyback-splicingoftheexon6ofNM_001100422,-splicing
siteofhsa_circ_0003071wasconfirmedbyPCRamplificationandthefirst-

analysisshowedthathsa_circ_0003071hasproteintranslationpotential,harboringanopenreadingframethatmay

(has-miR-604andhas-
miR-1205),
ofcircRNA-miRNA-

thesetargetgenesweresignificantlyenrichedinmRNAsurveillancepathwayandHipposignalingpathway.
Conclusion:ThisstudyshedlightonthebasiccharacteristicsofthenovelcircRNAhsa_circ_0003071ingastric
cancer,regardingtheexpressionlevel,backsplicingsite,RNaseRresistance,
analysesfromperspectivesofproteintranslationalprotential,circRNA-miRNA-mRNAgeneregulatorynetworkand
thesurvivalandprognosticroleofthekeydownstreamtargetgenesingastriccanceroffernewideationfor
functionalstudyofhsa_circ_0003071.
KeywordsSPATS2L;hsa_circ_0003071;miRNA;functionprediction;prognosticanalysis
随着测序技术和生物信息学的飞速发展,研究噬[14]、基因转录[15]、上皮间充质转化调节[5]、药物
人员已发现越来越多的非编码RNA(non-coding抵抗性[16]等)
RNA,ncRNA)。作为ncRNA家族成员,环状RNA精子发生相关丝氨酸丰富2样(spermatogenesis
(circularRNAs,circRNAs)在人类疾病中扮演着非associatedserinerich2like,SPATS2L)基因,又名应
常重要的角色。其中,环状RNA是一类具有组织和激颗粒和核仁蛋白(stressgranuleandnucleolar
细胞特异性表达模式的ncRNA的成员[1]。在结构[17]
protein,SGNP)。,包含
方面,circRNA是共价环状的RNA,。Danielle等研究表明SPATS2L是
RNA并通过反向剪接产生的,没有5'帽结构和3'多一个可能具有至少30个剪接变体的复杂基因
聚腺苷酸尾结构[1]。在哺乳动物细胞中,环状RNA[18]
座,并且它是一个在许多组织中高表达的基因,
至少可以分为两种类型,包括外显子衍生的环状比如胸腺、肺组织等[19]。目前,尽管关于基因
RNA和套索内含子衍生的环状RNA[2]。此外,环状
SPATS2L在生理学和病理学过程中的机制研究较
RNA由于其特殊的结构对RNaseR消化有抵抗少,但是有研究表明它在某些生理学过程和疾病的
力[3]。一般来说,环状RNA在组织细胞中的表达量
发生发展中发挥着关键的作用。近些年,多个研究
是很少的[4],但是有些环状RNA却比它们相应的线
团队通过全基因组关联研究(Genomewide
性RNA表达更丰富[5],这提示环状RNA在该组织associationstudy,GWAS)成功地鉴定了多种疾病的
细胞中具有某些特殊功能。通过大量研究发现环状遗传风险基因座,其中多项研究发现基因SPATS2L
RNA广泛存在于人体健康组织与病理组织中,比如与多种疾病发生发展及预后相关。例如,Himes等
大脑[6]、胸腺[7]、宫颈癌[8]、结核[9]等。研究人员利通过GWAS确定了在哮喘患者中SPATS2L为一种
用越来越多的证据阐述了circRNA在生物学和病理新的支气管扩张反应基因,并且进一步实验证明敲
过程中具有多种功能[10],例如通过充当微小RNA除SPATS2L将导致β2肾上腺素能受体水平升
(microRNA,miRNA)海绵[11]、干扰剪接[12]、产生多高[19]。Wang等利用GWAS证实了尘肺病的遗传易
肽或者蛋白质[13]等,调控多种生命活动(如细胞自感位点中存在多个单核苷酸多态性(single
22:.
第3期黄伟,、功能及预后分析
nucleotidepolymorphisms,SNPs),其中一个SNP鉴
[20]1材料与方法
定为SPATS2L中的rs985256。此外,Wang等也
通过GWAS发现SPATS2L中存在多个SNPs,
一步表明SPATS2L可能通过调节β2-肾上腺素能受TRIzol试剂、引物购自Invitrogen公司、反转录
体的蛋白表达间接影响空腹血糖水平,从而增加葡试剂盒PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNA
萄糖的吸收。另外,Wang等研究团队指出Eraser(CodeNO:RR047A)、实时定量PCR试剂盒
SPATS2L的高表达与EGFR扩增和CDKN2A缺失TBGreenTMPremixExTaqTMⅡ(CodeNO:RR820A)、
的胶质瘤的预后呈负相关[21]。近来许多研究指出,RNase-freeH20均购自TaKaRa公司,组织RNA提
基因SPATS2L在人体多个系统中起着非常重要的取试剂盒plus(RN002plus)购自奕衫生物公司,DNA
作用。比如,Zhu等在骨骼肌细胞的基因诱捕实验maker(-02)购自OMEGA公司,DNAloading
中,发现基因SPATS2L参与了核糖体的生物发生和buffer购自Takara公司,PARISKit(AM1921)购自生
翻译控制,进一步研究阐明在氧化应激和外源化合命技术公司,RNaseR(Epicentre,RNR07250)购自
物亚***,RNaseR纯化试剂盒RNeasy
糖体RNA的加工或输出[17]。Smeland等表明精神MinEluteCleanupKit购自Qiagen公司。5对新鲜冰
分裂症与海马体积之间共享一个靠近基因冻胃癌与癌旁组织取自于广州医科大学附属第五医
SPATS2L的基因座rs1653290[22]。Fuentes等表明院,在获得手术切除的组织之前,患者已签署了知情
在一项韩国研究队列中,SPATS2L中的SNPs与收同意书。此实验获得了广州医科大学附属第五医院
缩压和舒张压有关。此外,SPATS2L还参与淋巴细医学伦理委员会的批准。
胞的活化[23]、蛋白复合物生物发生[17]等生理过程,
以及通过调控脑源性神经营养因子影响慢性腹痛患的PCR扩增验证及测序验证
者睡眠质量等病理过程[24]。根据在circBase数据库(http:∥.
经过高通量测序技术的高速发展,研究员在人org/)中检索得到的hsa_circ_0003071序列,设计一
类各种疾病中发现了大量新颖环状RNA,特别是在对引物来扩增出包含反向剪接位点的序列,引物序
癌症中。目前,随着环状RNA在肿瘤研究的深入,列为:ForwardPrimer5’-CTTC
于肿瘤中探索新颖的环状RNA已迫在眉睫。因此,GTGGGGTCACAGAACAAT-3’;ReversePrimer
我们根据circBase[25-28]收录信息,发现人类基因5’-TCCTTCTCGCAGCCATTCATG-3’;Β-ACTIN,
SPATS2L可通过反向剪接产生12个环状RNA,我ForwardPrimer5’-TCGGTTGGAGCGAGCATC-3’;
们从样本分布较为广泛,同时评分较高的环状RNAReversePrimer5’-TGTGGACTTGGGAGAGGACTG-3’。
中重点关注到hsa_circ_0003071,从其表达量、反向利用APPLIEDBIOSYSTEMS7500REALTIME
剪接位点的验证、是否耐受RNaseR、亚细胞定位、PCR平台检测胃癌中PCR扩增的产物hsa_circ_
蛋白质翻译潜能五方面探究其基本特征,利用生信0003071。PCR扩增的模板为细胞的cDNA,扩增产
预测该环状RNA的miRNA结合位点以及miRNA物的长度为159bp。%琼脂糖凝胶
的靶基因,构建circRNA-miRNA-mRNA分子调控网电泳检测后,送广州艾基生物技术有限公司进行第
络,对上述靶基因合集进行基因本体论(Gene一代测序。
Ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书((RibonudeaseR,RNaseR)处理
EncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)分析,,用Trizol法提出细胞
利用STRING在线工具绘制下游靶基因集的蛋白质的总RNA。
互作网络图,
“MCODE”鉴定出关键基因,最后做关键基因在胃癌组,各10μgRNA,分别加入20U(2U/μg)的RNase
中的生存分析。本研究我们首次关注到一种新颖的R和等量的ddH2O,37℃孵育10min。
环状RNAhsa_circ_0003071在胃癌中的表达量、
构特征、功能及预后,这为后续深入研究环状RNAKit试剂盒纯化经RNaseR消化得到的RNA,随后
在胃癌的发生发展中的具体机制以及治疗胃癌提供分别测定2组RNA浓度。
一种新的思路。
23:.
广州医科大学学报(JGZMU)2022,50(3)
RTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒将纯化后的析,并利用KEGG分析功能进行信号通路分析。
RNA逆转录成cDNA,
ExTaqTMⅡ试剂盒进行PCR扩增,(https:∥-db.
下:TBGreenTMPremixExTaqTMⅡ10μl,ROXorg/)中7种活性互作来源,分别为“Textmining”、
ReferenceDyeⅡ,,“Experiments”、“Databases”、“Coexpression”、
ddH2O6μl,cDNA2μl,一共20μl。“Neighborhood”、“GeneFusion”、“Cooccurrence”
,对hsa_circ_
、细胞核RNA分离及提取收集细0003071预测的下游靶基因集合绘制蛋白质互作
胞,用试剂盒(PARISTMKitAM1921)将细胞质、细图,。随后,利
胞核中的RNA分离并提取出来,“MCODE”筛选关键
和细胞核RNA浓度的测定。基因。

RNA各500ng,将其逆转录成cDNA,此过程所用试利用UALCAN(http:∥/)
剂盒同“”。随后以该cDNA为模板进行实时数据库hsa_circ_0003071预测的下游关键基因在胃
定量PCR,反应体系和反应条件同“”。癌中的生存预后分析。

2结果
通过circRNADb(http:∥/
circrnadb)
译蛋白的潜能,并根据收录数据绘制该环状RNA为了鉴定环状RNA在胃癌及癌旁组织的相对
翻译蛋白的示意图。表达量,我们通过Q-PCR技术扩增hsa_circ_
,结果显示hsa_circ_0003071在胃癌组织中
分别利用circInteractome(http:∥(图1)。
/)和circBank()2个在线hsa_circ_0003071
数据库来预测环状RNA上miRNA的结合位点,并10
*****
取2个数据库预测结果的交集作为环状RNA可能1
beside
靶向结合的miRNA:hsa-miR-604和hsa-miR-1205。



种算法预测得到的靶基因作为hsa-miR-604和hsa-
miR-1205的潜在靶基因。LSYDWLFHLZKNLBH
-miRNA-mRNA网络的构建图1hsa_circ_0003071在胃癌和癌旁组织的表达量
通过选取miWalk数据库中9种算法预测hsa-
miR-604和hsa-miR-
预测hsa-miR-604和hsa-miR-1205的所有靶基因,鉴定
根据竞争性内源性RNA(competingendogenous,为了鉴定我们研究的环状RNA的剪接位点,我
ceRNA)理论,,琼脂糖凝胶电泳
circRNA-miRNA-mRNA网络,并将其可视化。网络检测,结果显示成功扩增出包含hsa_circ_0003071反
图的节点代表不同的RNA分子,连线代表节点之向剪接位点的大小为159bp的片段(图2A)。序列
间的相互作用。分析表明,hsa_circ_0003071来源于基因SPATS2L
,含有一个外显子,外显子
利用DAVID(http:∥/)数据库中3’端反向剪接于5’端。此外,测序结果进一步证实
“FunctionAnnotationChart”功能模板分别对预测的这一结论,箭头左端为基因SPATS2L外显子末端序
miRNA靶基因集合进行GO生物过程和分子功能分列,右端为外显子的起始序列(图2B)。
24:.
第3期黄伟,、功能及预后分析
AB
NM_001100422
hsa_circ_Marker00030711号外显子6号外显子13号外显子
2000110120
1000Backsplicing
750
500
250
100
6
hsa_circ_0003071
;
图2hsa_circ_0003071反向剪按位点鉴定
;175hs1a_c175hs1aic
22
内表达定位分析
号外
CircRNAs稳定闭环结构的存在使RNaseR不0
,/
能将其识别降解,因此比线性RNA更稳定,能耐受+.号显号
*2k2k
RNaseR消化。hsa_circ_0003071、CDRas的表达与对)MrMr
(号显子
照组比较差异无统计学意义(P>),而GAPDH-
基因的线性mRNA表达则明显降低(P<),表明号显%
3h56N4BN6<;=>?@>1g5h
hsa_circ_0003071、CDR1as耐受RNaseR的消化ppplpnga56c
(图2A)。分离细胞的胞核、胞质RNA后,用qPCRA
20
分别检测胞核与胞质中hsa_circ_0003071、UI号子
4号&
snRNA(U1)、GAPDH和CDRlas的相对分布量。已2,号
1+号
知U1RNA主要定位于胞核,GAPDHRNA主要定e*号'
3)外Agh:17;
位于胞质,以U1和GAPDH分别作为胞核和胞质2(号
1号显'3h56N4BN6<;=>?@>1g5h
定位的参照。U1和GAPDH分别主要位于细胞核号显号ppplpng
和细胞质,提示本实验胞核、胞质RNA分离成功;号显&
;、细胞核
胞核(胞质与胞核RNA含量比值约为8),表明hsa中的表达;与对照组比较,P<
_circ_0003071主要位于细胞质;与hsa_circ_图3hsa_circ_0003071对RNaseR抵抗性及在细胞质、
0003071类似,阳性对照环状RNACDR1as也主要细胞中的分布情况
分布于细胞质,与之前的报道相符[10](图3B)。20175h
20sh

环状RNA可以不依赖于5’端帽子结构而依
cirMk
赖内部核糖体进入位点(IntemalRibosomeEntrye35h
Site,IRES)的顺式调控元件来启动蛋白翻译。Hsa号外显子%&'()&*+
_circ_0003071含有一段符合IRES特征的元件,其,-./0子外显子011121345
*6378
起始-终止位点分别为73-109,。6N4Bp
124aa
并且hsa_circ_0003071存在一个开放阅读框
(OpenReadingFrame,ORF),编码一条含124个氨
基酸的蛋白质,起始密码子始于第128位核苷酸,终
止密码子位于环绕两周后的第8位核苷酸(2r+8),a_5h
见图4。图4hsa_circ_0003071的蛋白翻译示意图
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