文档介绍：生物技术制药
大分子:多肽蛋白,来源于生物体,不容易提纯;小分子:为化学小分子,来源于化学合成,容易提纯。
。1)selfpriming;2)Replacementsynthesis。
1)oligodT(n=12~18),它引导的cDNA合成必须从3’开始;2)随机引物(n=6),随机合成6~10寡核苷酸片段作为引物;3)基因特异性引物(n=18~25),当RNA序列或部分序列已知时。
—PCR相比,建立的cDNA文库有什么好处。
1)cDNA文库是以mRNA为材料,排除了真核基因组内含子的干扰,而且对于一些RNA病毒来说,cDNA文库是研究它们的唯一可行的方法;2)cDNA基因文库的筛选简单易行;
3)由于每一个cDNA克隆都代表一种mRNA序列,这样在选择中出现假阳性的几率比较低;
4)cDNA是双链可以克隆到载体上,能无限扩增,可以随时满足需要,RT—PCR的产物第一链cDNA为单链,不能扩增,一旦用完就没有了。
。SV40、CMV、MLP
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1)2个LTR(长末端重复序列)(其插入宿主基因组作用,5’还有启动子作用);2)φ(装配信号,指导结构蛋白表达);3)MCS(多克隆位点);4)backbone(大肠杆菌中增殖必备部分)。
。启动子、载体的转录终止信号和高效多聚腺苷酸(ploy(A))加尾信号、选择标记基因。
?在完成基因克隆之后,大多数的研究人员希望重新把这个基因的自然体和突变体导入到各种细胞来分析它的功能特点,这个过程称之为转染。
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(一)非病毒介导转染法:1)钙转染法(沉淀);2)脂质体转染法(形成双层质膜包埋DNA);
3)DEAE—葡聚糖转染技术促进哺乳动物细胞捕获外源DNA);4)电转染(在高压电脉冲作用下使细胞膜上出现微小孔洞,促使细胞吸收);5)压缩DNA转染法(将DNA压缩成为小颗粒);6)利用细胞周期转染法(利用G2/M周期细胞分裂时细胞膜的空隙增大);7)显微注射法(直接将目的基因通过注射器注入受体细胞中);8)提高转染率(提高细胞内的激酶的pH);(二)病毒介导转染法:逆转录病毒介导法,病毒介导法(通过感染宿主细胞将外源基因整合到染色体中)。
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指细胞中含有逆转录病毒结构蛋白基因,能够表达病毒的结构蛋白,是逆转录病毒载体转染入细胞后能够合成具有感染型的病毒粒,这种细胞称为装配细胞。
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1)β—半乳糖甘酶基因(lacZ):利用它可以进行蓝白斑筛选,大肠杆菌产生的β—半乳糖甘酶能够催化乳糖水解为单糖,是x—gal第五变蓝色;2)萤火虫荧光素酶基因:在Mg2+、ATP、O2的参与下催化荧光素氧化脱羧,产生激活态的氧化荧光素,并放出光子,产生550~580nm的荧光,通过测定荧光酶基因表达检测各种启动子活性,它可以克隆启动子下游,定量测定启动子效率;3)细菌荧光酶:以脂肪醛为底物,在还原型黄系单核苷酸及氧的作用下,在脂肪醛氧