文档介绍：生物技术制药实验四(1)
实验四:土壤中放线菌的分离
实验学时:5学时
实验类型:验证性实验、综合性实验
实验要求:必修
一、实验目的
? 从土壤中分离、纯化放线菌;初步掌握微生物的分离纯化方法和操作技术。? 了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。
二、实验内容
筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。迄今为止,已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。土壤中放线菌最丰富,品种齐全。通常情况下,放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。随着地理分布、植被及土壤性质的不同,放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌,从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。土壤中含有的放线菌主要是链霉菌,人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌,如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等,它们是生物活性物质重要的产生菌。但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少,常规的分离方法很难得到。
对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量,以提高放线菌的获得率。用干热和苯酚处理可减少链霉
菌数量和比例的方法,可以分离得到更多种类的放线菌。
土壤中分离放线菌的方法很多,其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等,本实验主要采用稀释法来获得放线菌。
注:从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。首先应根据筛选目的确定试验模型,然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据是扩散原理,即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。
三、实验原理、方法和手段
原理一:稀释涂布平板法;如图1。
原理二:对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量;
原理三:向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长,但不影响放线菌的生长。
四、实验组织运行要求
根据本实验的特点、要求和具体条件,采用“采用集中授课形式,分组试验进行”的组织运行模式。
五、实验条件
试剂与仪器
试剂:可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4·3H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、琼脂、盐酸、氢氧化钠、pH试纸、重铬酸钾
仪器:微波炉、电磁炉、干燥箱、玻璃涂铲、50或100mL量筒(灭菌)、90mm培养皿(灭菌)、1或2mL移液管(灭菌)、标签纸、小玻璃珠
(灭菌)、洗耳球。
培养基:高氏1号合成培养基:可溶性淀粉20 g,KNO3 g,K2HPO4·3H2O g,NaCl g,FeSO4·7H2O g, MgSO4·7H2O g,pH:—,琼脂20 g,水1000 mL,分装,高压湿热灭菌。
培养基制备过程(授课教师准备):称取一定量可溶性淀粉,放入装有少量水的小烧杯中,用玻棒将淀粉调成糊状,再加入少于所需水量的沸水中,继续加热,使可溶性淀粉完全溶化。再称取其他各成分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入,·,