文档介绍：该【诺如病毒核酸标准样品的制备方法 】是由【开心果】上传分享，文档一共【11】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【诺如病毒核酸标准样品的制备方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。诺如病毒核酸标准样品的制备方法
专利名称:诺如病毒核酸标准样品的制备方法
技术领域:
本发明涉及一种病毒核酸标准样品的制备方法,尤其是一种省时省力、稳定性高、均匀性好的诺如病毒核酸标准样品的制备方法。
背景技术:
诺如病毒(Norovirus,NV),属杯状病毒科、沃克病毒属的小圆状结构病毒,呈20面体对称,无包膜,电镜下缺乏显著的形态特征,与动物嵌杯病毒不同的是没有明显的嵌杯凹陷或表面孔洞,在***化铯(CsCl)。对各种理化因子的抵抗力较强,耐***、酸及热,IOO0C30分钟不能完全灭活。诺如病毒在病毒引起的肠道传染病中属常见的致病源,它已成为非细菌性肠胃炎的最主要致病源。该病毒传染性极强,容易引起暴发流行,若治疗不及时或治疗方法不正确,轻者影响人体的生长发育,严重者可导致脱水死亡。近年来,该病毒引起的病例有上升的趋势,对该病的诊断控制尤为重要,但由于诺如病毒不能体外繁殖、无动物模型、不能用组织培养法或动物实验进行分离检测等,阻碍了对该病的病原学、致病机理、诊断方法的研究和防治措施的制订。由于该病毒不但具有上述的特殊性,而且该病毒属于RNA病毒,其RNA极其容易被降解,各自实验室提取
RNA病毒,不但费时费力,而且很难保持其稳定性和均匀性,难以保证实验室的质量控制。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题,提供一种省时省力、稳定性高、均匀性好的诺如病毒核酸标准样品的制备方法。本发明的技术解决方案是一种诺如病毒核酸标准样品的制备方法,其特征在于按如下步骤进行
在离心管中加入Trizol裂解液1000μI、感染诺如病毒粪便200μI、加入***仿200μI震荡混匀,10000g离心15min;吸取上清液500μI加入到500μI异丙醇中,反复颠倒混匀,10000g离心15min;弃去上清后,倒置于吸水纸上,沾干液体,加入75%的酒精1000μ1,颠倒洗涤,10000g离心IOmin;再弃去上清后,倒置于吸水纸上,沾干液体;4OOOg离心lOsec,用吸干管底的液体,室温干燥3min;,溶解管内的RNA,2OOOg离心5sec,4°C保存,做为模板备用;
-PCR反应b-
5XM-MLVBuffer4μ1,dNTPs()2μ1,M-MLV(5υ/μ1)μ,,反转录游引物(20pmol/>L)μ,;所述反转录游引物是5’-TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’;b-
42°C水浴lh2h;b-
IOXPCRBuffer(含Mg2+)2·5μ1,dNTPs(各2·5mmol/L),TaqDNA聚合酶(5U/μυμ,上游引物、下游引物(20ρπιο1/μ1)各μ,b-,用无菌水补充至25μ1;
所述上游引物是5’-TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’;
所述下游引物是5’-TCACTATGATGCTGATTACTC-3’;
b-°C预变性3min;94°C变性lmin,53°C退火lmin,72°,30个循环;72°C5min;4°C保存;
,回收目标分子DN***段;
-Ι连接体系
c步骤所得到的纯化的目的片段4μ1,2XRapidligationbuffer5μ1,PGEM-T载体
,,室温连接Ih;d-2转化
将上一步骤的连接产物加入到感受态细胞中,轻轻混匀,冰浴2Omiη,42°C热应激lmin,冰浴2min,加入800μ1SOC培养基,,IOOOg离心IOmin,弃去培养液,加入新鲜的SOC培养基200μ1,混匀后涂在含有Amp+的LB平板上,风干后,37°C倒置培养12tTll0h;
d-3阳性克隆的筛选
挑取单克隆菌进行培养,用PCR方法进行阳性克隆的筛选,PCR体系及反应条件如b-3、
b-4;
;
将e步骤所得质粒用SalI进行单酶切,反应体系为10XHBuffer5μ1,Sailμ,质粒ΙΟμΙ,双蒸水34μ1;37°C2h,用Omega回收试剂盒回收线性化质粒;转录反应体系为10XT7RNApolymerasebufferδμΙ,ΤΤ5μ1,NTPΙΟμΙ,Rnasinμ,线性化质粒5μ1,Τ7RNApolymeraseμ,DEPC处理水28μ1;37°C2h,然后再加入IOUDnaseI2μ1,37°C,30min。本发明不仅制备过程省时省力,而且所制备的诺如病毒核酸标准样品稳定性高、均匀性好,可以为诺如病毒检测研究、医药研究、应用研究等提供标准样品,以实现不同实验室结果的比对,从而保证实验室的质量控制。
图I是本发明实施例诺如病毒聚合酶基因的RT-PCR扩增电泳图。图2是本发明实施例诺如病毒聚合酶基因系统发育树。
、人感染诺如病毒粪便200μI(购于中国疾病预防控制中心
)、同时设阳性对照、阴性对照。加入***仿200μI震荡混勻,10000g离心15min;吸取上清液500μI加入到500μI异丙醇中,反复颠倒混勻,
10000g离心15min;弃去上清后,倒置于吸水纸上,沾干液体,加入75%的酒精1000μ1,颠倒洗涤,10000g离心IOmin;再轻轻弃去上清后,倒置于吸水纸上,沾干液体;4OOOg离心lOsec,用微量加样器吸干管底的液体,室温干燥3min;,轻轻混匀,溶解管内的RNA,2OOOg离心5sec,4°C保存,做为模板备用;
-PCR反应b-
5XM-MLVBuffer4μ1,dNTPs()2μ1,M-MLV(5υ/μ1)μ,RNA酶抑制剂
,反转录游引物(20pmol/>L)μ,;所述反转录游引物是5’-TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’;
b-°C水浴lh2h;b-
IOXPCRBuffer(含Mg2+)2·5μ1,dNTPs(),TaqDNA聚合酶(5U/μυμ,上游引物、下游引物(20ρπιο1/μ1)各μ,b-,用无菌水补充至25μ1;
所述上游引物是5’-TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’;
所述下游引物是5’-TCACTATGATGCTGATTACTC-3’;
上述引物均为人工合成;
b-°C预变性3min;94°C变性lmin,53°C退火lmin,72°C延伸
,30个循环;72°C5min;4°C保存;
PCR电泳结果如图I所示图中出现明显目的条带,M为DL2000Marker;1为诺如病毒聚合酶基因;2为阴性对照;
(货号DV805A),并按其操作说明回收目标分子DN***段;
-Ι连接体系
c步骤所得到的纯化的目的片段4μ1,2XRapidligationbuffer5μ1,PGEM-,,室温连接Ih;d-2转化
将上一步骤的连接产物加入到感受态细胞(购于大连宝生物公司)中,轻轻用移液器混匀,冰浴20min,42°C热应激Imin,冰浴2min,加入800μ1SOC培养基,,IOOOg离心lOmin,弃去培养液,加入新鲜的SOC培养基200μ1,混匀后涂在含有Amp+的LB平板上,风干后,37°C倒置培养12tTll0h;d-3阳性克隆的筛选挑取单克隆菌进行培养,用PCR方法进行阳性克隆的筛选,PCR体系及反应条件如
b-3、
b-4;
;
应用Omega公司质粒回收试剂盒回收质粒;
将e步骤所得质粒用SalI进行单酶切,反应体系为10XHBuffer5μ1,Sailμ,质粒ΙΟμΙ,双蒸水34μ1;37°C2h,用Omega回收试剂盒回收线性化质粒;转录按照宝生物公司体外转录试剂盒说明书进行。反应体系为10XT7RNApolymerasebuffer5μ1,DTT5μ1,NTPΙΟμΙ,Rnasinμ,线性化质粒5μ1,Τ7RNApolymeraseμ,DEPC处理水28μ1;370C2h,然后再加入IOUDnaseI2μ1,37°C,30min。将e步骤所回收的质粒通过宝生物公司ABI3730进行测序。结果如下TCACTATGATGCTGATTACTCCCGGTGGGACTCAACACAACAAAGAGCCGTGTTAGCAGCGGCTTTAGAAAT
CATGGTCAAGTTCTCCCCAGAGCCGCATCTGGCCCAAAAGGTTGCAGAAGACCTTCTTTCTCCCAGTGTGATGGACG
TGGGTGATTTTAAAATATCAATCAATGAGGGTCTCCCCTCCGGGGTGCCCTGCACCTCCCAATGGAATTCCATCGCC
CACTGGCTCCTCACTCTATGTGCACTCTCTGAGGTTACAAACCTGTCCCCTGACATTATCCAGGCCAACTCTCTCTT
TTCTTTCTACGGTGATGATGAAATTGTGAGCACAGACATAAAATTGGACCCAGAAAAGCTGACAGCAAAACTCAAGG
AATACGGGTTGAAACCGACCCGCCCTGACAAGACTGAGGGACCCCTTGTTATCTCTGAAGACCTGGATGGCCTAACC
TTCCTGCGGAGGACCGTGACCCGCGACCCAGCAGGCTGGTTTGGAAAGTTGGAACAGAGTTCAATACTCAGACAAAT
GTATTGGACTAGGGGCCCCAACCATGAAGACCCATCTGAAACAATGATACCACACTCCCAGAGGCCCATACAATTGA
TGTCTTTGCTGGGTGAGGCCGCACTCCACGGCCCAGCATTCTACAGCAAAATCAGCAAACTGGTCATTGCAGAGTTG
AAGGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCAAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCGGATCTGAGCAC
GTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGTTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGA
本发明扩增了诺如病毒聚合酶基因的部分片段,全长823bp,将本发明毒株聚合酶基因序列提交NCBI数据库进行核苷酸序列相似性检索,结果表明该毒株序列与GII-4基因群序列核苷酸相似性最高。见表I。表I诺如病毒聚合酶基因核苷酸序列blast结果
权利要求
,
1000μI、感染诺如病毒粪便200μI、加入***仿200μI震荡混匀,10000g离心15min;吸取上清液500μI加入到500μI异丙醇中,反复颠倒混匀,10000g离心15min;弃去上清后,倒置于吸水纸上,沾干液体,加入75%的酒精1000μ1,颠倒洗涤,10000g离心IOmin;再弃去上清后,倒置于吸水纸上,沾干液体;4OOOg离心lOsec,用吸干管底的液体,室温干燥3min;,溶解管内的RNA,2OOOg离心5sec,4°C保存,做为模板备用;-PCR反应b--MLVBuffer4μ1,dNTPs()2μ1,M-MLV(5υ/μ1)μ,,反转录游引物(20pmol/>L)μ,;所述反转录游引物是5’-TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’;b-°C水浴lh2h;b-(含Mg2+)2·5μ1,dNTPs(),TaqDNA聚合酶(5U/μυμ,上游引物、下游引物(20ρπιο1/μ1)各μ,b-,用无菌水补充至25μ1;所述上游引物是5’-TCATTCGACGCCATCTTCATT-3’;所述下游引物是5’-TCACTATGATGCTGATTACTC-3’;b-°C预变性3min;94°C变性lmin,53°C退火lmin,72°,30个循环;72°C5min;