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专利名称:诱导花生不定芽的方法
技术领域:
本发明涉及一种组织培养诱导花生丛生芽的方法,特别是涉及一种高效诱导花生不定芽的方法,属于生物技术领域。
背景技术:
花生是一种重要的油料作物和经济作物,在我国种植面积较大。提高花生的产量、质量,离不开优良品种,花生组织培养是利用生物技术进行花生育种的一个重要环节。目前,有些作物建立起了高效的植株再生体系,筛选出高诱导率基因型(如水稻的日本晴,中华11),但大多数作物的植株再生率仍很低(1%-30%),成为限制基因工程技术应用的瓶颈。目前花生丛生芽诱导率报道的平均不超过50%,且稳定性和重复性差。花生高效再生体系的建立是花生基因转化的基础。植株再生受基因型影响很大,同时也和外植体类型及培养基配方有关。细胞分裂素在组织培养诱导芽再生中比较有效,BA和TDZ在多种作
发明内容
本发明要解决的技术问题提供一种诱导率高、稳定性高、重复性好的组织培养诱导花生不定芽的方法。本发明的技术方案
一种诱导花生不定芽的方法,包括如下步骤
(1)种子预培养选取成熟的豫花1号花生种子,先用70%乙醇浸润20-30S,%的HgCl2溶液消毒8-lOmin,用无菌水冲洗5飞次,然后在无菌水中浸泡23h,将花生种皮去掉,再去掉一片子叶,将剩下带有胚芽的另一半子叶接种于不添加激素的MS培养基中培养,培养温度2526°C,光照时间12-14h/d,光照强度1000-2000Ix,培养4天;
(2)外植体制备将培养后的花生子叶掰掉,夹紧胚轴,用无菌刀片将花生幼叶从基部切下,将幼叶横切,平均分成三份,或从近叶柄1/3处一分为二,得到外植体;
(3)诱导和分化将外植体接种在诱导培养基中培养,培养温度为2526°C、光照时间12-14h/d,光照强度1000-2000lx,培养7-8天后外植体边缘出现绿色芽点,转到继代培养基中,再培养18-22天获得诱导芽。所述诱导培养基为MS+BA3mg/L+-+-++BA5mg/L+NAAlmg/L+。本发明的有益效果
(1)本发明通过严格筛选,选出基因型豫花1号作为外植体,经过种子预培养、外植体制备和诱导、分化等环节,得到花生不定芽,比目前文献报道的花生丛生芽的诱导率高,经多次接种试验证明,诱导率结果稳定,重复性较好。(2)本发明优化了芽诱导培养基配方,使外植体萌发不定芽的时间大大提前,萌发时间从原来的14天左右,提前到7-8天。(3)
本发明方法可获得稳定的高诱导率,豫花1号在三种不同的培养基上培养(MS+BA3mg/L+++;MS+BA3mg/L+++;MS+BA3mg/L+++),芽诱导率稳定在90%以上,%,%,%。而同样条件下开农49、开农30、豫花15号在MS+BA3mg/L+++,%、^%,^%。可看出,豫花1号作为外植体时的不定芽诱导率比其他品种优势明显。
图1豫花1号外植体在MS+BA3mg/L+NAAO·8mg/L++。图中外植体切口边缘的绿色突起为诱导产生的不定芽。图2:开农49(对照)外植体在MS+BA3mg/L+NAAO·8mg/L++。图中外植体切口边缘的绿色突起为诱导产生的不定芽,黄、白色为愈伤组织。从图1、2可以看出,在相同的培养基和培养条件下,豫花1号外植体的芽点多而且长势旺;开农49(对照)外植体芽点较稀少,而且外植体边缘产生白色的疏松愈伤组织,说明豫花1号和开农49基因型间的芽诱导率存在显著差异。图3豫花15号(对照)在三种不同的培养基上的外植体诱导不定芽对照图图中
外植体切口边缘的绿色突起为诱导产生的不定芽,黄、白色为愈伤组织。图中(1)培养基为MS+BA3mg/L+NAAO·8mg/L++;(2)培养基为MS+BA3mg/L+++;(3)培养基为MS+BA3mg/L+++。从图3可看出,同一基因型(豫花15号)在不同培养基上,不定芽的诱导反应不同。图中(2)和(3)较(1)诱导出较多愈伤组织,但不定芽诱导率均较低,诱导率不足40%。
具体实施例方式
以下结合实施例详细说明本发明,其中出现的百分比浓度如无特别说明,均指质量百分比浓度。实施例1诱导花生不定芽的方法,包括如下步骤
1、种子预培养选取颗粒饱满、较大、表面无裂痕、没有出胚芽的豫花1号成熟种子,用镊子加入无菌三角瓶中,先用70%乙醇浸润30s,%的HgCl2溶液消毒8min,用无菌水冲洗5飞次,然后在无菌水中浸泡23h,待花生种皮舒展之后,在超净工作台上用镊子将花生种皮去掉,再去掉一片子叶,将剩下带有胚芽的另一半子叶接种于装有MStl(MS培养基不添加任何激素)培养基的无菌罐头瓶中,置光照培养室中,在25°C、光照强度为20001x,光照14h/d条件下培养4天;
2、制备外植体用镊子将花生的子叶掰掉,之后夹紧胚轴,再用无菌刀片将花生幼叶从基部切下,将幼叶近叶柄部1/3处一分为二;
3、诱导和分化将外植体分别接种在诱导培养基中,芽诱导培养基为MS+BA3mg/L+++,置光照培养室25°C、光照强度为20001x,光照14h/d条件下培养,经过7-8天,部分外植体切口边缘可见绿色芽点出现;14天左右,所有外植体边缘均出现大量绿色芽点。两周后,转到继代培养基中,使芽点进一步分化,继代培养基为MS+BA5mg/L+NAAlmg/L+,再培养18天得到诱导花生不定芽。经统计,诱导率达到
100%ο实施例2诱导花生不定芽的方法
种子预培养选取颗粒饱满、较大、表面无裂痕、没有出胚芽的豫花1号成熟种子,用镊子加入无菌三角瓶中,先用70%乙醇浸润20s,%HgCl2溶液消毒lOmin,用无菌水冲洗5飞次,然后在无菌水中浸泡23h,待花生种皮舒展之后,在超净工作台上用镊子将花生种皮去掉,再去掉一片子叶,将剩下带有胚芽的另一半子叶接种于装有MStl(MS培养基不添加任何激素)培养基的无菌罐头瓶中。置光照培养室中,在26°C、光照强度为1500lx,光照12h/d条件下培养4天。制备外植体用镊子将花生的子叶掰掉,之后夹紧胚轴,再用无菌刀片将花生幼叶从基部切下,将幼叶横切平均一分为三。诱导和分化将外植体分别接种在诱导培养基上
MS+BA3mg/L+++,置光照培养室26°C、光照强度为1500lx,光照12h/d条件下培养,经过7-8天,部分外植体切口边缘可见绿色芽点出现;14天左右,几乎外植体边缘均出现大量绿色芽点。两周后,转到继代培养基上,继代培养基为MS+BA5mg/L+NAAlmg/L+,使芽点进一步分化,再培养22天得到诱导花生不定芽。经统计,%。实施例3同实施例1基本相同,不同之处在于培养室条件26°C、光照强度1000lx,光照13h/d;
芽诱导培养基:MS+BA3mg/L+++,%ο说明书摘要
本发明涉及一种高效诱导花生不定芽的方法,包括选取成熟的豫花1号花生种子,先用70%乙醇浸润,%的HgCl2溶液消毒,用无菌水冲洗,然后在无菌水中浸泡,将剩下带有胚芽的另一半子叶接种于不添加激素的MS培养基中培养,培养4天;将培养后的幼叶横切,平均分成三份,得到外植体;诱导和分化,将外植体接种在诱导培养基中培养7-8天后外植体边缘出现绿色芽点,转到继代培养基中,再培养18-22天获得诱导芽。本发明选出基因型豫花1号作为外植体得到花生不定芽,优化了芽诱导培养基配方,经多次接种试验证明,芽诱导率稳定在90%以上,重复性好。
权利要求
一种诱导花生不定芽的方法,其特征在于该方法包括如下步骤(1)种子预培养 选取成熟的豫花1号花生种子,先用70%乙醇浸润2030s,%的HgCl2溶液消毒810min,用无菌水冲洗5~6次,然后在无菌水中浸泡2~3h,将花生种皮去掉,再去掉一片子叶,将剩下带有胚芽的另一半子叶接种于不添加激素的MS培养基中培养,培养温度25~26℃,光照时间1214h/d,光照强度10002000lx,培养4天;(2)外植体制备 将培养后的花生子叶掰掉,夹紧胚轴,用无菌刀片将花生幼叶从基部切下,将幼叶横切,平均分成三份,或从近叶柄1/3处一分为二,得到外植体;(3)诱导和分化 将外植体接种在诱导培养基中培养,培养温度为25~26℃、光照时间1214h/d,光照强度10002000lx,培养78天后外植体边缘出现绿色芽点,转到继代培养基中,再培养1822天获得诱导芽。
,其特征在于所述诱导培养基为MS+BA3mg/L+-+-+。
,其特征在于所述继代培养基为MS+BA5mg/L+NAAlmg/L+。全文摘要
本发明涉及一种高效诱导花生不定芽的方法,包括选取成熟的豫花
1号花生种子,先用70%乙醇浸润,%的HgCl2溶液消毒,用无菌水冲洗,然后在无菌水中浸泡,将剩下带有胚芽的另一半子叶接种于不添加激素的MS培养基中培养,培养4天;将培养后的幼叶横切,平均分成三份,得到外植体;诱导和分化,将外植体接种在诱导培养基中培养7-8天后外植体边缘出现绿色芽点,转到继代培养基中,再培养18-22天获得诱导芽。本发明选出基因型豫花1号作为外植体得到花生不定芽,优化了芽诱导培养基配方,经多次接种试验证明,芽诱导率稳定在90%以上,重复性好。