文档介绍：考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
专业班级:制药工程 3班小组成员:李梦娴李敏林晓丝
一、实验目的
1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理
2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤
二、实验原理
1、根据蛋白质的理化性质,有多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250是比色法与色素法相结合的复合方法。考马斯亮蓝G-250是一种染料,在游离状态下呈棕红色,当与蛋白质结合后呈青蓝色。在一定范围内,也就是蛋白质含量在0~1000ug范围内,蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比,所以可用比色法测定。
2、考马斯亮蓝G-250法有常量法和微量法两种。
三、仪器与试剂
1、仪器:分析天平;铁架台;大漏斗;洗瓶;烧杯100ml×2、
50ml×1;吸管10ml×2、5ml×1;胶头滴管;移液枪;离心管10个;722型分光光度计;容量瓶100ml×3;洗耳球×2;玻璃棒;记号笔。
2、试剂:
(1)蒸馏水。
(2)标准蛋白质溶液:用移液枪吸取1ml浓度为1mg/ml标准蛋白质溶液,溶于蒸馏水并定容至10ml,。
(3)考马斯亮蓝G-250(%)染液:-250,溶于5ml 90%乙醇中,加入85%(m/v)的磷酸10ml,最后用蒸
馏水定容至100ml(此溶液不宜久存,在常温中可放置1~2个月);将定容好的染液过滤并装入棕色瓶中保存。
(4)样品液:用移液枪取1ml纯牛奶液体(经调查,~),用蒸馏水稍做稀释,然后转移至一号100ml的容量瓶中并定容至100ml;用10ml的吸量管吸取10ml一号容量瓶中的液体于二号100ml的容量瓶中,最后用蒸馏水定容至100ml,此时二号容量瓶中为待测样品液。四、操作步骤
1、0~100μg/ml标准曲线的制作:
取8支离心管,编号后,按下表加入试剂,盖塞后,将各试管中的溶液纵向倒转混匀,室温静止5min后,以管一为空白对照,在595nm 下比色测定。以标准蛋白质含量(μg)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘出标准曲线。
2、样品中蛋白质含量测定
另取两支干净的试管(做一重复),标号A、B。分别加入1ml待测样品液体和5ml考马斯亮蓝染液,将两支试管中的溶液纵向倒转混匀,室温静止5min后,测定方法同上,由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
五、数据处理
1、将测得的吸光度填入上表中,并根据数值作出标准曲线。
2、计算公式:样品中的蛋白质含量(μg/g鲜重)={[查得的蛋白质含量(μ
g)] ×稀释倍数}/ [样品鲜重(g)]
六、注意事项
1、如果要求严格,最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收,因为这段时间内颜色是最稳定的。
2、测定中,蛋白-染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上,不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)。可用塑料或玻璃比色皿,使用
后立即用少量95% 的乙醇荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或***长时间浸泡。
3、若选择在漩涡器上混合,注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难以消除。
七、思考与讨论
1、制作标准曲线及测定样品时,为什么要将个试