文档介绍：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验
1、电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下,不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷,因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同,即它们的电泳迁移率不同,因此,可使它们分离。
2、影响电泳迁移率的外界因素:电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。 3、影响电泳迁移率的内在因素:质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。
4、采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高,对样品无拖尾和吸附现象等优点。
5、醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯,将它溶于有机溶剂(如:***、***仿、***乙烯、乙酸乙酯等)后,涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构,厚度约为120 μm,有很强的通透性,对分子移动阻力很小。 6、本实验以醋酸纤维素为电泳支持物,分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同,在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物,,染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快,其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白。
? 器材
醋酸纤维素薄膜(3×8cm),培养皿,载玻片,电泳仪,电泳槽,粗滤纸,镊子? 材料
新鲜血清(未溶血)
? 试剂
1、巴比妥缓冲液(pH ,):
, ,加水至1000ml。置4℃冰箱保存,备用。(已配置)
2、染色液:氨基黑10B , 甲醇50ml, 冰醋酸10ml,蒸馏水40ml,混匀。
3、漂洗液:含95%乙醇45ml,冰醋酸5ml,蒸馏水50ml,混匀。
4、NaOH溶液:称取NaOH 16g,定容至1000ml。
×8cm的小条,,表示点样位置。
,,使之完全浸泡透。
,用滤纸吸去多余水分。用毛细管吸取新鲜血清约5ul,,然后轻轻压在划痕处,待血清完全浸入膜内以后移开载玻片。
二、电泳
将点样后的薄膜置于电泳槽支架上,无光泽面朝下,点样末端置于负
极。槽架上用四层滤纸作桥垫,膜条与滤纸必须贴紧,平衡5分钟后通电,电压110伏,电泳1小时左右关电源。
三、染色和漂洗
通电完毕后,用镊子将膜取出,直接浸于染色液中2分钟后取出,立即浸泡于漂洗液中,反复漂洗,直至背景漂洗净为止。用滤纸吸干薄膜。
四、定量(洗脱法)
⒈取6支试管,编号,,剪下薄膜上各条蛋白色带。另于无色部分剪一大小与色带相仿的薄膜作空白对照。
⒉将各条区带分别放入试管内,不时摇动,待蓝色完全脱下后。在波长650nm处比色。以空白调零,分别读出各蛋白组分的光密度,然后计算出总光密度:
光密度总和T=清蛋清(A)+A1+A