文档介绍：过氧化氢酶测定改良方案
过氧化氢酶活性测定
两步反应:第一个是过氧化氢酶(CAT)催化H2O2的歧化,即两个H2O2先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上,发生反应歧化反应生成两个H2O 和一个氧气分子。CAT的浓度越高,分解速度越快。该反应非常迅速,在一分钟内即可完成,可以通过叠氮钠终止反应。经过该歧化反应后。剩下的过氧化氢反应混合产物能促进第二个反应的发生,过氧化氢、4-氨基-氨替比林(4-Aminoantipyrine)和苯酚在过氧化物酶(POD)的作用下生成红色的亚醌类化合物Qulnonelmine dye,该物质在500nm处有最大吸收峰。用过氧化氢标准品,制作标准曲线,这样就可以计算出样品中的过氧化氢酶在单位时间单位体积内催化了多少量的过氧化氢转变为水和氧气,从而可以计算出样品中过氧化氢酶的酶活力。
a. 配制250mM过氧化氢溶液。由于过氧化氢不是非常稳定,使用前需自行测定过氧化氢的实际浓度。用过氧化氢酶检测缓冲液将30%的过氧化氢稀释至浓度约为10mM。测定A240。
过氧化氢(mM)= × A240(什么比色皿?常量?微量?) 从而计算过氧化氢的实际浓度。然后再根据实际的过氧化氢浓度配制250mM过氧化氢溶液。
b. 配制5mM过氧化氢溶液。根据测定得到的实际过氧化氢浓度配制
5mM过氧化氢溶液。
c. 配制显色工作液
% 4-AA溶液, % 苯酚溶液, 40U/ml POD溶液。 ,(200ml)
配制200ml 磷酸钾缓冲液,用时再稀释。
称取K2HPO4?H2O(=),KH2PO4(= ),用蒸馏水定容到200ml,搅拌混匀,。
% 4-AA(4-氨基-氨替比林)溶液(50ml)
4-AA用蒸馏水定溶至50ml。
% 苯酚溶液(100ml)
。
40U/ml 过氧化物酶(POD,100U/mg)溶液(5ml)
2mg POD用蒸馏水定溶至2ml。
3. 标准曲线测定
a. 取0、、25、,分别加入过氧化氢酶检测缓冲液至最后体积为100微升,混匀。
b. 各取4微升,加入200μl显色工作液。25℃至少孵育15分钟后测定 A500,但孵育时间不宜超过45分钟(注:本步骤可以和样品测定步骤中的最后一步同时进行)。
4. 样品测定
样品体积
Buffer
250mM过氧化氢溶液空白对照(blank) 0 40 μl 10 μl 样品(sample) x μl 40-x μl 10 μl
a. 参考上表,取x微升(0-40微升),加入过氧化氢酶检测缓冲液至体积为40微升(即加入40-x微升过氧化氢酶检测缓冲液),混匀。再加入10微升250mM过氧化氢溶液,用移液器迅速混匀。25℃反应1-5分钟。
b. 加入45