文档介绍：酶联免疫吸附试验(ELISA)
讨论报告:
酶联免疫吸附试验(ELISA)
:指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上,进行免疫反应的定性和定量方法。
:(1)抗原或抗体的固相化(2)抗原或抗体的酶标记(3)加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,由此进行定性或定量分析。
大致流程:
酶免疫组化
均相酶免疫测定酶免疫技术
酶免疫测定固相酶免疫测定非均相酶免疫测定液相酶免疫测定
这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定
(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay),简称ELISA。
ELISA实际是一种抗原抗体反应和酶催化反应具有以下性质:
可逆性
特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学
结构和空间构型互补关系,具有高度的特异性。因此测定某一特定的物质,
而不需先分离待检物。
存在最适比例
可用左图表示,即抗原抗体比例高于或低于某一特定适宜值,二者结合效果都会降低。
敏感性高由于酶的催化效率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA的主要测定方法
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体,各种那个测定方法中均有三个
必要试剂:
(1)故乡的抗原或抗体,即“免疫吸附剂”(2)酶标记的抗原或抗体,称“结
合物”(3)酶反应的底物
此法适用于检验各种蛋白质
等大分子抗原,例如 HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。步骤如图:
用特异性抗原进行包被和制备酶
结合物。此法中受检标本不需稀释,
可直接用于测定,因此其敏感度相对
高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg
的检测常采用本法。本法关键在于酶
标抗原的制备,应根据抗原结构的不
同,寻找合适的标记方法。
间接法测抗体
多用于传染病的诊断。
间接法的优点是只要变换
包被抗原就可利用同一酶
标抗抗体建立检测相应抗
竞争法
当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体。
,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
。所以按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。
ELISA中用的蒸馏水或去离子水,包括用于洗涤的,应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品,同时也作为判断结果的对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致,多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称; 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较,可以估计标本物质的量。阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含 HBsAg,最好抗HBs也是阴性。
标本的采取和保存体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。 6.
以血清标本为例:血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。
血清标本应避免溶血:红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以 HRP为标记的ELISA测定中,可能会增加非特异性显色。
(1)加样:在ELISA中一般有3次加样步聚,即加标本,加酶结合物,加底物。加
样时应将所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。
(2)保温:抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。
ELISA属固相免疫测定,抗原