文档介绍：霍乱弧菌检验操作规程
1 范围
本操作规程规定了带菌者粪便,患者粪便、呕吐物、肛拭子,外环境水样,水生动物、食品等标本中的霍乱弧菌的检验方法。
2 检验依据
国家传染病诊断标准:WS 289—2008
卫生部疾病控制司《霍乱防治手册》第五版
北京市卫生防疫站《卫生防疫微生物检验操作规程》
《北京市常见传染病防制工作手册》
(北京市疾病预防控制中心传地所2008年12月内部资料)
3 设备和材料
冰箱: -20℃~4℃。
恒温培养箱: 36±1℃。
暗视野显微镜: 10×~100×。
架盘药物天平: 0g~500g, 。
锥形瓶: 100 mL、500 mL。
灭菌吸管: 1mL ()、10mL ()。
灭菌平皿: 直径90 mm。
灭菌试管:10 mm×75 mm、16 mm×160 mm.。
灭菌注射器: 1 mL。
载玻片。
盖玻片。
无菌棉签。
500mL灭菌采样瓶。
生物安全柜:Ⅱ级。
4 培养基和试剂
碱性蛋白胨水(- , 10—15mL/管, 10× 50mL/瓶)。
庆大霉素琼脂(15-20 mL/块)。
普通营养琼脂(15-20 mL/块)。
半固体培养基(3mL/小管,5mL/中管)。
霍乱弧菌单克隆抗体(国家CDC流研所提供, 5—10μL/菌落)。
泰国S&A诊断血清(5—10μL/菌落)。
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5 检验程序
霍乱弧菌检验程序见图1。
6 标本的收集与送检
要求见表标准与要求(一)—(四)
7 操作步骤
快速辅助诊断:其结果只是初步报告,不是确诊报告。
动力及动力抑制试验:
如是急性期病人的水样便,则用接种环或滴管取1滴水样便在玻片上然后盖上盖玻片,直接用暗视野显微镜观察动力;或加生理盐水
1滴在玻片上,用接种环取较干的便1 环放置生理盐水中研匀,盖上盖玻片直接用暗视野显微镜观察动力;高度可疑的标本可取已增菌的碱性蛋白胨水1滴在玻片上然后盖上盖玻片,直接用暗视野显微镜观察动力。如在镜下见到穿梭样运动(象夜空中的流星)即动力试验阳性,否则阴性。
动力试验阳性的标本,则取O1和O139群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体各2滴放置玻片上,取标本1滴或1环放在其中研匀,盖上盖玻片,用暗视野显微镜观察是否有原来的穿梭样运动,如穿梭样运动已迅速停止并凝集成块状即动力抑制试验阳性,否则阴性。
动力试验和动力抑制试验结果可口头初步报告,但不是确诊报告。双阳时口头报告高度可疑。
分离培养
粪便、呕吐物和肛拭子:对急性期病人水样便标本在碱性蛋白胨水增菌培养的同时可用接种环取一满环或用棉拭子直接接种在庆大霉素琼脂培养基上;所有病人标本都应接种碱性蛋白胨水增菌培养。37℃增菌6~8h后,从菌膜下表层取一接种环培养物,把接种环在试管壁上轻轻碰一下,待接种环上留有残液后划线接种