文档介绍：:文库精确的定量对于二代测序的结果是非常重要的,过低估计文库的大小,导致clusters或多重模板太多,数据质量不高,过高估计文库的大小,导致数据读取量少,基因组覆盖率低,所以低估或者高估文库的量都会影响测序效果。qPCR是DNA文库定量的金标准,也是唯一一种能够准确检测出分子数目的方法。KAPA文库定量试剂盒包含6个10倍稀释的DNA标准品,10×PrimerPremix,搭配有KAPASYBRFASTqPCR试剂盒,十分准确的确定文库的分子数目。DNA标准品片段长度为452bp,两端包含定量引物的结合位点。通过标准曲线计算得到定量结果。基于qPCR方法的文库定量主要取决于三个因素:①准确、重现性非常好的标准品的使用;②用于qPCR的DNA聚合酶有较高的扩增效率,且扩增效率均衡;③重复性好。KAPASYBRFASTqPCR试剂盒具有高性能、高通量、实时定量PCR等特点。该试剂盒包含一种基因工程酶,耐受SYBRGreenⅠ染料的抑制作用,KAPASYBRFASTqPCR试剂盒是文库定量的理想产品,该试剂盒也适用于扩增高AT、GC以及1kb以上的片段。:KAPAIlluminaGA文库定量试剂盒是用于文库定量的理想产品:定量引物序列:PrimerP1:5’-GA-3’PrimerP2:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’浓度范围广;包含高GC含量的片段;扩增片段长度:50~1000bp。:1)将1mlPrimerPremix与5ml的KAPASYBRFASTqPCRMasterMix(2×)充分混合;2)制备好的DNA文库稀释3个梯度,即:1:2000、1:4000、1:8000;3)qPCR反应体系:试剂加入量引物与KAPASYBRFASTqPCRMasterMix的混合物12μlddH2O4μl稀释的DNA文库及标准品(1~6)4μl总体积20μl*也适用于10μl体系,引物与KAPASYBRFASTqPCRMasterMix的混合物加6μl,模板加4μl。4)qPCR反应程序:程序温度时间预变性95℃5min变性95℃30s35cycles退火/延伸60℃45s*1熔解曲线分析是可选的,但在某些情况下,熔解曲线可以反应文库是否有非特异扩增及引物二聚体的污染;2KAPASYBR®FASTqPCR试剂扩增速度快,较长的退火延伸时间能够增加文库的覆盖范围,当片段长度在700bp以上时,建议退火延伸时间为90s。5)分析数据:确认标准品及文库扩增效率在90~110%;6)计算文库浓度:采用绝对定量方法,:注意事项:在qPCR反应前,将1mlPrimerPremix与5ml的KAPASYBRFASTqPCRMasterMix(2×)混合,漩涡震荡10s;建议反应体系为20μl;确认所有试剂充分溶解并混匀后待用;可选项:为了避免DNA粘附在耗材表面,建议采用10mMTris-HCL,+%吐温20稀释DNA文库,相关试剂需另行配置。第一步::1000,稀释时使用专门配置的稀释缓冲液(10mMTris-HCL,+%吐温20),稀释体系如下:稀释缓冲