文档介绍：植物基因工程
——根癌农杆菌介导法
——农杆菌
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
——原理
根癌农杆菌的细胞内有一个大的致瘤质粒,简称Ti质粒,其上有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中。
因此,农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系, 改造的Ti质粒就是一个优良的植物转基因载体。
——Ti质粒结构特点
转移到植物基因组中的DNA序列,与肿瘤形相关。
激活T-DNA的转移,使植物致瘤,是毒性区。
调控Ti质粒在根癌农杆菌之间的转移,是接合转移编码区。
调控Ti质粒的自我复制,为复制起始区。
Ti-质粒的基因结构
T-DNA区
(transferred DNA region)
Vir区
(virulence region)
Con区
(region encoding conjugation)
Ori区
(origin of replication)
——Ti质粒的改造 策略
由于野生Ti质粒直接作为植物基因工程载体,存在许多障碍,故对野生型Ti质粒可以采取两种不同的改造策略——一元载体系统和二元载体系统。
相较而言,二元载体更多优点:
1、构建方便;2、效率高;3、不会带人大量无用的冗余DNA序列。
——一元载体 (卸甲载体)
切除T-DNA中的致瘤基因,仅保留两侧边界与T-DNA准确转移所需的25个碱基序列。
在T-DNA区中删除致瘤基因位点插入与中间载体同源的质粒序列。
用特定转移方法转移中间载体,发生同源重组。
根据中间载体所携带的抗性基因进行筛选。
用筛选后的菌株侵染植物组织细胞。
三、诱导和启动毒性区基因表达
把植物受伤细胞提取液加入培养基,Vir区基因均被诱导和活化。
Vir接收信号 VirA编码受体蛋白(受体蛋白与化学信号分子结合) C端活化(具激酶功能,使组氨酸残基磷酸化)VirA蛋白被激活(转移其磷酸基团至Vir蛋白)Vir族蛋白活化
四、类似接合孔复合体的合成和装配
五、T-DNA的加工和转运
六、T-DNA的整合