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1)硫酸铵沉淀后直接过疏水柱,应该用多大浓度的硫酸铵平衡柱子啊
看你蛋白情况了,,挂太牢就适当降低盐浓度,一般要
,.
你有个贴子中说在纯化过程中上样的样品中pH和盐浓度,以及种类等组分一定要平衡缓冲
液完全相同至少相当。我想试试你说的硫酸铵沉淀后直接过疏水柱,那我是不是要先确定复
溶后样品的盐浓度再确定平衡缓冲液的盐浓度啊,如果是我怎么检测样品的盐浓度啊
其实差不多就可以,也不一定特别严格,例如疏水盐浓度你的样品的盐高于平衡的也可以,但
是别相差太多,尤其不能样品的盐浓度小于平衡缓冲液,这样也许挂不住,或者会产生沉淀.
而缓冲液和盐浓度不同混合也许会产生沉淀,所以要小心,而一样的缓冲液体系和盐浓度可
以避免这样的问题.
硫酸铵沉淀后的样品,如果是上清按盐浓度稀释到你缓冲液盐浓度就可以,如果是沉淀,直接
用缓冲液去溶解,沉淀里的盐可以忽略.
最好的办法你可以用电导的方法去检测,只要样品的电导和你的平衡缓冲液一样就可以了.
2)我在用镍柱亲和纯化后,蛋白已经比较纯了,仅在银染时能看见微弱的杂带(目的蛋白约
25KD,杂蛋白约40KD)。但我还想试试能不能完全去除杂带。此前试过分子筛没效果,所以
想试试离子交换。想请教一下,在变性条件下可以做离子交换吗?和复性后再做比起来哪个
效果好呢?非常感谢!!
浓度太低一些杂带是很难出现的,所以这样的纯度很难说,我觉得得浓度高到25mg/ml左右,
,因为这
时候蛋白是链状分子或者是不蜷曲的,不是球型,所以在这样的柱子中没有办法使他们分离,
你最好的方法是优化你的亲和纯化条件,也可以在纯化前做好预处理,如果是包涵体,可以用
分级沉淀的方法来初纯,亲和柱子的缓冲液中加点土温或者用pH洗脱和咪唑洗脱的方法配
合,同时用阶段洗脱的方法,一般都能做得很好,用试剂盒的方法或者线性洗脱的方法有时候
很难得到好的效果,你也许可以参考我们的方法,你留下邮箱我给你发一份做参考吧.
我觉得离子交换也不一定好,在脲这样的变性剂下可以做离子交换,但是效果也不一定好,我
.
3)重组蛋白A琼脂糖凝胶FF能一次纯化大量血清IgG吗?如几十毫升。:.
如用环氧活化的琼脂糖凝胶纯化血清IgG,先要偶联其相应配基如抗体或蛋白A是吗?这里
琼脂糖凝胶用环氧活化的意义是什么?
几十毫升如果一次纯化也就用几十毫升的重组蛋白A琼脂糖凝胶FF就可以,也可以分两三次
纯化,这都没有问题,如果是你想做血清中的抗体纯化也可以把抗原偶联到环氧活化琼脂糖
凝胶上,这样得到的抗体更纯,一般不选择蛋白A,环氧活化便宜,而且相成的键很稳定,
没有非特异吸附,是个不错的方法.
4)谢谢色谱兄,能告诉我分级沉淀的具体操作步骤和缓冲液中添加吐温的浓度吗?
分级沉淀包涵体其实很简单,用6M盐酸胍溶解包涵体,然后用缓冲液稀释到5M,然后混匀离
心,上清继续稀释到4M,如此类推,一直到1M,这样把每次的沉淀和上清跑电泳,就可以知道
在哪个浓度下包涵体中目标蛋白是最纯,而且收率是最高的,这样得到的包涵体蛋白比普通
的洗涕方法要干净而且纯净,再纯化就好多了.
%吐温可以降低非特异吸附,使洗脱的蛋
白更纯,其他的操作和一般没有什么差别,材料我已经发了,请查收.
5)兄,请教一下如何测柱效呀!谢谢先
一般柱效是常用1%的柱床体积的丙酮过柱子,柱效=柱高/理论塔板数,而每米理论塔板数=5.
54/(Ve/W1/2)2,其中Ve是保留体积,W1/2=半峰宽,一般很少测定这个值.
我的是1毫升的预装柱,
因为上样环最小100微升,所以就上了100微升的丙酮,然后用蒸馏水冲洗,没有峰出来,
后来我用2毫升的NACL冲洗了5个柱体积,还是没有峰出来,然后我想里面可能没有物质
了,就用蒸馏水想冲平,结果出现了3个峰
都搞不懂是些什么物质。
丙酮测柱效的时候洗脱液不是用蒸馏水1的吗?
1ml的预装柱根本不需要测定柱效的,如果不是凝胶过滤也许需要,如果是亲和和疏水等没
有这个必要,你不出峰我觉得是检测波长不对,因为丙酮在280估计吸收非常弱,你得换个
波长,洗脱水就可以。后面出的应该是杂质。:.
6)chromatography兄:您好!因为我对色谱一窍不通,所以有一些基本的问题想请教于您。
我现在正准备用HPLC分离提纯一种细菌的外毒素,它是一种碱性丝氨酸蛋白,分子量大约
是33KDa,按照文献的方法,是先用硫酸铵分级沉淀后再上疏水柱(HIC,phenylsepharos
ehighperformance,Pharmacia),然后再用凝胶过滤柱((withSuperose6HR10/30,P
harmacia),我查了一下,这两种柱子好像都是预装柱。我想问你的是,什么情况需要发放
大?是多大的量?我只是想分离出来做单抗和测序以及做免疫保护性,那么需不需要放大?
另外:这样的两根预装柱加起来差不多要花4000美元,代价太昂贵了,那么有没有便宜的
柱子且纯化效果也不错的?
最后一个问题:如果我想让公司代为纯化,您觉得可行吗?如果可行,请问你知不知道哪里
有这样的公司?
你好,其实你这个纯化不一定需要专门的预装柱,当然你要用也可以,我们公司就有苯基琼
脂糖凝胶柱子和填料,你要做多大都可以,至于凝胶过滤Superose6是比较贵的,何况是
预装柱,你可以用sephadexG-50应该也可以,这样组合会比较便宜,公司做纯化一般是比
较贵的,你做多少量呢,一般钱给少了公司觉得不合适,多了,你觉得贵,纯化这样的蛋白
估计也上万元,而且看你难度不同收费也不一样,我觉得你还得自己做。你做的量估计不需
要多大,100mg足够用了吧。这样不需要多大的柱子就可以。
7)蛋白在合成中形成了醋酸盐,请问如何分离纯化和检测?谢谢!
不很明白,电泳不能检测吗,也可以用HPLC的凝胶柱子去检测,纯化和成盐关系不大,只要调
,很难说用什么方法.
8),应该选阴离子柱,但是目的蛋白和一些杂蛋白都穿过。但用
阳离子CM柱后却能挂柱,经洗脱后纯度很好。请问这该如何解释?
这个很正常,你的这个蛋白用阴柱或者阳柱都可以,因为它的等电点在中性,所以都可以用,
至于穿过也许pH不够高,或者吸附力弱,再不就是预测有偏差.
9)在做HPLC之前要求将样品过滤,但是我的样品过滤以后就没有活性了,有可能样品与超
滤膜结合了(但活性丢失的真正原因我不能确定)。现在想问色谱兄,怎样进行该蛋白质的
进一步纯化!:.
样品过滤不该用超滤的膜,,没有活性那蛋白也没有了吧,我
怀疑是超滤膜把蛋白截留了,这样样品当然没有活性了
10)色谱兄你好!我买了WHATMAN的纤维素DE52阴离子层析柱,我想问一下,上样洗脱后,
层析柱最后应洗脱到什么程度,是不是要基线跑平了才行?这样后下次使用,用不用再生?
怎样再生,用碱还是用酸?多大浓度?DE52规定使用的pH范围是2-。怎样贮存好?
,再用水洗,保存可以保存在20%的乙醇
中也可以,其实你应该按照说明书的去做,
凝胶不是更好吗,这个填料有点老.
11)我准备用Gravity-flow柱纯化蛋白,但没有独立的UV检测仪和收集器。能否在FPLC
系统上直接运行,而不用启动泵?如可以要如何设置?或者有没有其他方法?
不知道你用的是AKTAprime还是AKTAexplorer,有不少型号的,我觉得不好接,因为这
些系统的管道很难靠重力可以流动液体,如果是AKTAprime也许好改点,你可以问他们的
工程师吧
12)谢谢chromatography,因为醋酸分子量很小,用电泳或凝胶柱效果可能不好,现在主要
是如何检测纯化后样品中的醋酸残留,因为没有对照品,测蛋白含量就不行了。能不能用醋
酸对照,用离子色谱测醋酸含量呢?没做过离子色谱,不知道用什么检测器合适,请chrom
atography朋友指点。
你说的是检测醋酸呀,我以为你是要把醋酸和蛋白分开呢,如果是检测,如果是这样,你可以
把你的样品加点盐酸,这样变成酸性环境那你的醋酸应该可以游离出来,毕竟蛋白会和盐酸
成盐,或者用硫酸也可以,然后你用气相色谱的氢焰检测器就可以检测,而且很灵敏,这样应
该就好了
谢谢,醋酸盐可以用GC测定,但若形成的是其它盐如硫酸盐或磷酸盐该如何测呢?
:.
如果是这些酸我可不知道怎么检测了,
在碱性条件下就不会成盐了,没有这么复杂吧.
13)请教chromatography:最近我想做关于蛋白纯化方面的实验,因为是新手,所以想请教
几个问题,谢谢!
我的蛋白是70~80KD左右的,HIS标签,怎样确定是以可溶形式还是包涵体形式表达呢?
若是包涵体是先让其溶解、复性再进行纯化,还是先纯化再进行溶解复性呢?我想用Ni+琼
脂糖凝胶进行亲和纯化,应选用什么型号的填料呢?实验过程应注意些什么呢?
破碎你的菌后,有上清也有沉淀,分别跑电泳,如果上清有目标蛋白,沉淀没有那说明是
可溶的,如果沉淀也有,说明两个都有,但是看哪个更浓,如果沉淀更多,那应该是包涵
体.
据说蛋白越纯越好复性,所以我觉得应该先纯化再复性,至于填料我们一直用我们公司的
产品,和进口没有什么差别,我把我们的材料发给你一份,里面很全面,希望有所帮助.
14)我今天本打算试试你所说的分级沉淀法初纯包涵体,但仔细想想还是有点疑问,需要再
请教你一下。
1、具体的操作步骤是不是应该用含8M尿素的buffer来超声破碎菌液沉淀,然后把上清用
不含尿素的buffer来稀释呢?
2、稀释时是将上清分为几份分别稀释后离心,还是要先稀释到7M,离心,再把上清稀释为6
M,依此类推呢?
3、比如说我稀释到3M时沉淀里的目的蛋白最纯,那我下面是应该选择含3M尿素的buffer
洗涤包涵体,再用含8M尿素的buffer溶解沉淀;还是应该直接用含3M尿素的buffer溶解
包涵体,离心后取上清用于下一步的纯化呢?
总之,我不太理解这样做的原理,还望不吝赐教,多谢!!!
1,一般都是破碎后再用变性剂溶解包涵体,.
,不是分几份.
,3M不溶解怎么纯化呢.
不好意思,再问一下,那我是不是应该先用一小部分包涵体试一下,如果发现3M最纯就直
?:.
另外,上清稀释后就可以直接离心吗?还是需要静置一段时间再离心呢?
先试试,摸好了就直接稀释到那个浓度就可以了,一般最好静置一两个小时
每一步都要静置吗?那岂不是要很长时间?
15)Hitrap的脱盐柱如何使用?,然后
接样品即为脱盐后的样品。
我不知道你的除盐柱是多大的柱子,一般除盐可以做到20-30%的柱床体积,你根据你的柱子
可以算出你能除盐的体积,你的预装柱都有说明书教怎么用,很简单,用平衡缓冲液冲柱子3
个床体积,然后上样,再用缓冲液冲,收集蛋白峰得到的就是不含盐的样品.
16),如果用融合蛋白(c-myc)有利于纯化,但不
知如何去除融合蛋白?,又不知如何纯化?
据说这样的融合蛋白不需要酶切,改变温度或pH就可以自动切去,除去还用原来的亲和柱就
可以,你也许可以带his标签,这样不大影响你的蛋白的结构和活性,如果不是融合蛋白,那
得看你蛋白特性,用疏水,离子交换等常规方法去纯化.
17)请问chromatography老师,蛋白质糖基化修饰后其纯化时的条件与修饰前会有什么样的
改变?我用毕赤酵母表达的蛋白可能被糖基化了,而组织中该蛋白是非糖基化的,用组织中
的提取条件怎么也不能将我表达的蛋白提纯,应怎么考虑,怎么办?
18)纯化糖蛋白可以用凝集素亲和或者硼酸亲和柱子去纯化,一般的蛋白不会被挂住.
19)我纯化的原核蛋白以可溶形式存在,但活性没有(含三对二硫键)。我看到一篇文章,
发现蛋白经还原和烷基化处理后,活性出现。不知那位高手告知原因为何以及还原和烷基化
的方法?
:.
我怀疑是二硫键错配,所以没有活性,当还原后再烷基化,这样不会再形成二硫键,也许这样
导致蛋白有活性,还原的方法很简单,加巯基乙醇或者DTT,搅拌,就可以还原,烷基化,
应该是巯基的修饰剂,常用的有DTNB,PDS,PMB(参考<酶工程>中的酶修饰章节)
20)关于蛋白质分离提纯方面,蛋白质的测定除了凯式定氮外,还有那些比较新而且权威的方
法,(BCA法过时了吗)?分离纯化时疏水层析,凝胶过滤,离子交换等方法梯度洗脱时,洗脱
液浓度是怎样变化的?
我可不是什么前辈,我们一般用BCA比较多,没有觉得过时,好象很多人都用这个方法.
洗脱离子交换盐浓度由低到高,可以用梯度混合仪或者机器自己带的混合系统实现,当然也
可以用阶段洗脱的方法,这样不需要专门设备,重现性好,很容易放大.
疏水和离子交换刚好相反,开始是高盐,洗脱是逐渐降低盐浓度,洗脱方式也可以用线性或者
阶段洗脱.
21)我发酵液中的目的蛋白含量少,所以想在等电点进行硫酸铵沉淀,请教仁兄:是不是用
酸碱把我的发酵液PH调到目的蛋白等电点,再进行硫酸铵沉淀就可以了?能用强酸强碱
吗,有什么注意事项吗?
如果你的目标蛋白含量太低不大适合用硫酸铵沉淀,当然你要调到等电点附近去沉淀也许能
行,得试试才知道,不知道这样蛋白是不是有活性,你只有试试才知道,你电泳要不浓缩看不
见目标蛋白的话,
,
滴加,避免局部浓度过高,此外沉淀对蛋白浓度是有要求的,太低不适合.
表达的蛋白如果有亲和标签的话,不需要浓缩可以直接上柱,柱子本身就可以浓缩富集你的
目标蛋白,如果没有标签,用离子交换或者疏水都可以浓缩你的样品而且可以初步纯化.
22)我想请教一下,我现在提取植物中的一种酶,含量可能很低(GUS酶),我直接用提取
液来提取,然后经过80%硫酸铵纯化,结果感觉特别粘稠。
是否多糖未除干净,有何简便的高招啊?
另外,跑聚丙烯酰胺凝胶电泳时发现跑的极其难看,很歪,而且是一开始浓缩胶的时候就跑
的歪歪扭扭的。(看溴酚蓝指示):.
最后染色是可以将所提取酶染成蓝色的一种染色剂,结果发现没有条带!真晕啊!
我是第一次做蛋白相关的东西,请指教!
(GUS酶)是这个β-葡糖醛酸苷酶吗,我怀疑没有提取好或者浓度太低所以电泳没有跑出
来,至于电泳开始就歪,怀疑是你的样品溶解不好,有沉淀或者盐干扰,电泳最好先除盐,
此外浓度太低不能用硫酸铵沉淀,我怀疑也许浓度低,
按理过离子交换柱子,植物中的样品做得不多,你多看看文献吧
23)你好,我现在用的QAEA-25出现死吸附,不能再生,看看有什么好的方法,我用过的再生
方法是2N的NaOH,、碱,(50%),还是不
行,请教一下您还有什么高招吗?
那就用盐酸胍或者脲洗看看,也许变性沉淀了,
蛋白酶试试.
24)分子量700的化合物应该选择G-10或G-15,如果是离子型的或用离子型交换剂可以
除去杂质的话就用QAE或DEAE,不过工业生产建议用G,因为QAE或DEAE体积受酸碱及离
子强度变化太大.
小分子物质最好别用凝胶过滤去分离,估计没有什么效果,除非是和很大分子的分离还可
以,带电荷那就选离子交换,也可以选择反相
25)您好,我有一个非常头疼的问题请教:
repgrad75柱,系统使用的是AKTApurify100,用装柱器一次性装入胶体,柱效测得88
50N/m,低于10000N/m的要求,但是由于流速1ml/min时压力逐渐升高我将在线滤器卸下,
压力降低后再测柱效为何变成了5500N/m?还想问问您装柱头时是否不能压得过紧?技术
支持说这样会导致峰前倾,我在最大流速3ml/min冲了1小时后将柱头压下6mm,测得的
,-,请问是否是因为我压胶过紧?
还想问问您装这种极细长的凝胶柱除了将胶一次性倒入外到底还有哪些因素影响柱效?
问了技术支持说没别的就得一遍遍装,逮到哪次算哪次,真是这样吗?柱子太大流速太慢,:.
从装好到测完柱效要2、3天,所以急盼您的指点,非常感谢!
我觉得测定柱效是其中的一个方面,最重要的是跑个样品试试看,我觉得你装柱子的一个
问题是在一次倒入填料后应该用最大流速去过柱子,等压力平稳后,你把柱子的转换头接
上压紧,这样再用低于你最大流速的来操作,压力不会升高,柱床也不会变化,其实对于压
紧的柱子也不一定需要重装,你可以反冲,这样压力一般就会平稳,别太迷信柱效测定,
因为还是有误差的,如果装完的柱子柱子前后效率差这么多,那这个填料就不好用,但是
填料本身应该没有问题,所以说不应该太相信这个东西,我一般装完柱子根本不测柱效,
一样用,此外我觉得纯化也别过分依赖凝胶过滤,装柱子时间长,而费时间也长,上样量
也少,其实成本很高,.
如果峰型不对称,那你要柱子中填料的面一定要平,这样才能保证你的峰型好.
26)我的蛋白酶分子量可能在300KD以上,可以用
可以用SephadexG-25Fine去除其中的盐份吗?
应该没有问题,蛋白不会沉淀或者过不了柱子的,它可以从填料的缝隙中过去,别担心,一
样能用,如果不放心,那也可以用G50,你先试试就知道了.
27)我正在做蛋白活性的分析,需用空载体PET28B-HIS蛋白作为空对照,但是它太小了怎
样才能得到呢?
抱歉,我不是做上游的,我觉得你可以随便找一个带his标签蛋白,它肯定没有你目标蛋白
的活性,这样做对照就可以了.
28)现有一个困扰我多时的问题向您请教。,利
用SP-sepharoseFF纯化时,在梯度10%-100%都有目的蛋白被洗脱。请问您是否遇到过这
种情况,据您考虑这是什么原因。非常感谢。
这个我没有做过,我觉得变性条件下蛋白特性和普通不一样也许造成这样的结果,你可以
参考包涵体清洗,那样就可以得到比较纯的蛋白,我觉得在变性条件下,非亲和的方法很
难做好纯化.
:.
29)神经细胞膜N-甲基-D-天冬氨酸受体蛋白纯化的技术路线及关键点的指导,有功能
活性,量少就可以,105KD的复合蛋白,用抗体结合柱子是否需要抗体量很大?
洗耳恭听!
抗体肯定需要很多的,一般每ml偶联抗体应该在10-20mg,那需要20-30mg抗
体,抗体也不便宜,你这样不如直接把N-甲基-D-天冬氨酸或者天冬氨酸偶联到填料上
做成亲和填料,,如果天冬氨酸可以
那就更简单,我们公司可以帮你合成,或者提供活化好的介质自己偶联.
30)我现在用glutathionesepharose4B纯化原核表达的GST融合蛋白(可溶性的),目
的蛋白大小47KD,pI=,但是纯化后在融合蛋白(73KD)下面60KD左右处有一条含量较
多的带,并且在50KD左右,40KD左右,26KD处都有很清晰的带,我裂解细菌时加了PMSF,
纯化过程是照说明做的,PBS洗的次数超过说明书的用量,还有一次加了1%的Tritonx-1
00,用还原型谷胱甘肽洗脱的pH=,总共做了三次,但每次结果都一样,目的蛋白只占
1/8左右,我的要求也不是很高,最起码也要60%就可了,但为什么那么多杂带呢?很郁
闷,请搂主帮帮我,谢谢!
怀疑是降解或者表达后自己降解或者破碎时候条件剧烈而断裂,所以有好几条带,你可以
用GST抗体做WB试试,你也而已用不同浓度原型谷胱甘肽洗脱看能不能得到更好的结果.
您说的降解的问题我也考虑过,但是我超声的时候加了PMSF,是不是还需要加别的东西,
表达后降解如何避免呢?我用GST以及目的蛋白做了WB,但我的这两个抗体都是多抗,做
出来都有带,特异性不是很好。您说的不同浓度原型谷胱甘肽洗脱,我可以试试。您还有
什么建议,请不吝赐教,非常感谢。
别客气,超声如果时间过长或者强度比较大,那也可以使蛋白断裂,杂带增加,所以你可以
试试缩短点时间,
换作用的,,使杂带减少.
我还有一点不明白,您说的(),其中缓冲也是指用来平衡柱
子的缓冲液吗?还是指超声时的缓冲液?还是洗脱时的缓冲液,对不起,我没有很好的理:.
解您的意思。再次让您费心了。谢谢!
,洗脱可以不加
我已经照您以上的意见作了,但结果还是一样,请问我该怎么办啊?求求您帮帮我!
那也许本身你表达出来已经降解或者象他们说的非完全表达,那这样是上游的问题,所以
,
用离子交换,凝胶过滤或者疏水做进一步纯化.
31)我的物质也是个小分子,
质,用QAE或DEAE就去除的很好,可是带色的杂质在柱子上就洗不下来了.
那可以用低浓度酸碱去洗,应该可以洗下来,如果还洗不下来用50-70%的乙醇试试.
32)请问亲和层析样品上柱之后目的蛋白洗脱不下来怎么办?我按照文献上面的方法,用p
,1MNaCL的醋酸缓冲液洗脱,杂蛋白可以洗下来,但是目的酶跑电泳检测和酶活检
测都没有,并且平衡缓冲液冲出的杂蛋白也没有目的酶。所以我怀疑是吸附在柱子上没洗
掉,又用含10%DMSO的洗脱液洗,还是没有。请帮忙指点一下该怎么办?
用更高浓度的盐,更低pH试试,此外也可以用一点变性剂如1-2M脲试试,加DMSO要小心变
性蛋白沉淀
33)我是一个新手,刚开始做RP-
?尽管进样前已用约10-15倍柱体积的5%bufferA(%TFA)去平
衡柱子了.
(SIGMA),上样量为100ug时总有多个峰,改为3
0ug时就只剩下一个峰;但将浓度梯度放缓,
呢?
谢谢!
:.
我没有做过几次HPLC分析蛋白,进样峰大也许还是样品本身的问题,你可以直接用缓冲液
或者水试试,看看是不是也这样.
后面的问题我不明白浓度梯度放缓,上样量为100ug时也只有一个峰是什么意思,是洗脱梯
度吧,我想如果是这样,那也许是上样浓度过高,而你的洗脱有机溶剂浓度高溶解不好吧,
仅供参考
34)请教chromatography大哥,我欲纯化精浆蛋白(前列腺特异抗原),前面的同仁最初试
过从精液中提取纯化,但据说跑出来的带分子量不对,请问这是怎麽回事?谢谢!
我不知道在哪里看过这个蛋白的纯化,好象是用亲和的方法,分子量不对差多少,仅靠分子
量是不行的,最好有活性测定的方法.
35)请教chromatography兄,我欲纯化一个分子量16K的蛋白,-,为什么很多文
献中提到的纯化方法是用阳离子柱,,那样的话,蛋白不就带负电荷了吗?还
有,我用酵母表达该蛋白,试用Q柱纯化时,色素大部分结合到柱上,不知道该怎么办?
用阳柱是不是主要去杂质的,色素不和你蛋白下来没有关系,+2MN
aCl洗看能不能洗掉。
36)还有个问题就是我做的工作是将鼠抗体人源化,肯定要用到大量抗原来筛库,前面人纯
化的精浆蛋白是不够的,有人告诉我将剩下的精浆蛋白在原核中表达,会比从前列腺组织
块中提取快,而且量也多,但有人说这样复杂,时间也长,我不知究竟该如何?请赐教!
我觉得如果在前列腺组织块含量高就不需要表达,如果不高那就表达,但是我觉得最简单
的方法还是提取,毕竟表达也天然的蛋白有时候是不一样的,何况也不是所有的表达都好
做,所以我觉得能提取还是提取的好。
37)请教chromatography兄,我是一个新手,欲纯化一个嗜盐性的酶,该酶至少需1M的N
acl才能有活性,请问我该如何设计纯化方案?
那只好用疏水了,我记得当初中科院微生物所的我的校友用的就是我们的苯基琼脂糖凝:.
胶,硫酸铵沉淀,过疏水.
38)我的(101kd)在上清中我已把它纯化,但有条杂带(30kd),请问我如何去掉杂带?
如果用DEAE-52层析柱,我容蛋白的buffer(50mMNaH2po4100mMNacl250mMimidalole),
Nacl浓度是不是太高了,如何处理?
我要做分子筛,针对线粒体蛋白,能给我一些建议吗?贵公司能否提供?谢谢。
最好优化你的纯化条件,没有必要再去做别的纯化,实在没有办法再做,否则浪费时间不
说就怕效果也不一定好,何况凝胶过滤处理量很小,不知道你用的什么方法纯化的,线粒
体蛋白分子量有多大,.
39)我有一个GST融合蛋白,分子量大概60KD,经亲和层析纯化后,SDS电泳检测,有3
条主要的蛋白带(也有其他的杂蛋白带),最浓的是我得目的蛋白,但是另外两条带的浓
度也很大,这两条带的大小加起来差不多是目的蛋白的大小。试了两次都这样。我想请问
这到底怎么回事?是目的蛋白降解的还是其他的杂蛋白?如果是降解的,如何确定?为什
么亲和纯化效果会这么差那?
我是蛋白领域的生手,正在为这个问题困扰不安,正好发现了chromatography的帖子,
请多指教!我已经在这个问题上折腾了很长时间了,所以很着急,能不能帮我想想办法?
谢谢!
怀疑是降解,你查查以前的帖子,你用GST抗体WB做看看有几条,如果还是三条那是降
解,如果不是,