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一种检测结核分枝杆菌特异性免疫应答的试剂及其用途
本发明公开了一种检测结核分枝杆菌特异性免疫应答的试剂及其用途。通过γ干扰素释放实验和血清酶联免疫方法,公开了一种结核杆菌免疫阳性试剂Rv0733,包括抗原或多肽及其类似物,用于检测结核病患者特异性细胞免疫和体液免疫应答水平。用本发明试剂免疫小鼠后,小鼠能产生特异性的γ干扰素等细胞因子及抗体。利用本发明体外刺激结核病人或正常人群T细胞,检测γ干扰素释放细胞的数量或培养上清中γ干扰素含量,能区分结核病人及正常人群;通过检测外周血清中抗本发明的特异性抗体的水平,可提高结核病患者的检测灵敏度和特异性;利用跟踪结核病患者治疗过程中Rv0733特异性免疫应答对比实验,能揭示结核病人的临床预后情况。
【专利说明】一种检测结核分枝杆菌特异性免疫应答的试剂及其用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学检验领域,具体涉及一种用于检测结核分枝杆菌特异性免疫应答的试剂及其用途。
【背景技术】
[0002]结核病是全球三大传染性疾病之一,2011年,WHO估测中国结核病总病例140万人,%,仅次于印度的310万(%),位居全球第二,,。结核病给我国造成了巨大经济和社会负担。
[0003]随着研究的不断深入,结核病的临床诊断方法有了较大的发展,但是在诊断的特异性和敏感性方面还存在一定不足,需要加以改进。免疫学检测方法是现阶段检测结核分枝杆菌感染的重要辅助方法之一,其中以抗原特异性刺激后的Y干扰素释放实验(IGRA)为主。现有的商业试剂盒有T-(QFT)-1T。其中,T--6和CFP-10,而QuantiFERON(QFT)-1T使用的抗原是ESAT-6、。这些抗原都由结核分枝杆菌特异性的RD(RegionofDifference)区基因编码,能较好地避免已接种的BCG(卡介苗)的干扰。
[0004]然而,现有报道表明ESAT-6,CFP-,,,-6,CFP-,所以当患者感染此类细菌时会出现结果的假阳性。而且已有文献表明我国人群存在较严重的非结核分枝杆菌感染情况,所以T-(QFT)-1T在我国结核病诊断应用中的效果不理想,表现为其检测的敏感性和特异性介于80%—90%之间,而且这二个试剂盒在结核病的临床预后跟踪后的检测价值较差。
[0005]因此新的T细胞反应性抗原的筛选,是提高结核病患者的诊断准确性及临床预后观察的新策略。人体在感染结核分枝杆菌后,体内会产生结核分枝杆菌特异性T细胞。体外用相同的抗原再次刺激机体T细胞时,能检测到大量的Y干扰素等细胞因子或分泌细胞因子的细胞,从而能区分出正常健康人和被结核分枝杆菌感染的人群。在临床针对性治疗进程中,随着患者体内结核分枝杆菌菌量会下降和病原抗原的消失,体内的抗原特异性T细胞会发生大量凋亡而进入收缩期,只保留少数的抗原特异性T细胞存在于体内,所以,在体外用抗原刺激不同治疗阶段的患者T细胞时,细胞因子的分泌量或分泌细胞因子的细胞数量与治疗前相比都会下降,并与疾病的缓解相一致,因而具有较好的临床预后价值。同时BCG表达的抗原与结核分枝杆菌毒性株中特有的抗原相比其安全性高。所以具有更好的亚单位或重组疫苗的研究价值和应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题之一是提供一种新的用于检测结核分枝杆菌特异性免疫应答的试剂。[0007]本发明要解决的技术问题之二是提供上述试剂的用途。
[0008]在本发明的一方面,提供一种检测结核分枝杆菌特异性免疫应答的试剂,包括Rv0733(Adenylatekinase,ADK)抗原或多肽或其类似物;所述Rv0733抗原的氨基酸序列从N端到C端如下:
[0009]VRVLLLGPPGAGKGTQAVKLAEKLGIPQISTGELFRRNIEEGTKLGVEAKRYLDAGDLVPSDLTNELVDDRLNNPDAANGFILDGYPRSVEQAKALHEMLERRGTDIDAVLEFRVSEEVLLERLKGRGRADDTDDVILNRMKVYRDETAPLLEYYRDQLKTVDAVGTMDEVFARALRALGKjnSEQIDNO:1所示;
[0010]本发明中,所述多肽为一种氨基酸聚合物,其长度包含但不限于20个氨基酸残基。所述其类似物为与其同源性在75%以上的多肽及经过天然或人工修饰后的氨基酸聚合物。所述多肽为编号ADK0-ADK16的氨基酸聚合物,其氨基酸顺序从N端到C端列于下:
[0011]ADKO:VRVLLLGPPGAGKGTQAVKLjnSEQIDNO:2所示;
[0012]ADKl:AGKGTQAVKLAEKLGIPQIS,如SEQIDNO:3所示;
[0013]ADK2:AEKLGIPQISTGELFRRNIE,如SEQIDN0:4所示;
[0014]ADK3:TGELFRRNIEEGTKLGVEAKjnSEQIDNO:5所示;
[0015]ADK4:EGTKLGVEAKRYLDAGDLVPjnSEQIDNO:6所示;
[0016]ADK5:RYLDAGDLVPSDLTNELVDD,如SEQIDNO:7所示;[0017]ADK6:SDLTNELVDDRLNNPDAANGjnSEQIDNO:8所示;
[0018]ADK7:RLNNPDAANGFILDGYPRSVjnSEQIDNO:9所示;
[0019]ADK8:FILDGYPRSVEQAKALHEMLjnSEQIDNO:10所示;
[0020]ADK9:EQAKALHEMLERRGTDIDAVjnSEQIDNO:11所示;
[0021]ADKlO:ERRGTDIDAVLEFRVSEEVL,如SEQIDNO:12所示;
[0022]ADKll:LEFRVSEEVLLERLKGRGRA,如SEQIDNO:13所示;
[0023]ADK12:LERLKGRGRADDTDDVILNRjnSEQIDNO:14所示;
[0024]ADK13:DDTDDVILNRMKVYRDETAPjnSEQIDNO:15所示;
[0025]ADK14:MKVYRDETAPLLEYYRDQLK,如SEQIDNO:16所示;
[0026]ADK15:LLEYYRDQLKTVDAVGTMDE,如SEQIDNO:17所示;
[0027]ADK16:TVDAVGTMDEVFARALRALGK,如SEQIDNO:18所示。
[0028]本发明中所述多肽可通过化学合成得到,也可通过基因工程技术得到,此技术为行业内所熟悉。
[0029]本发明所述抗原可以天然分离得到,也可以通过克隆技术和基因工程的方法获得融合蛋白,此技术为行业内所熟悉。
[0030]在本发明的另一方面,提供该试剂的用途,包括:本发明所述抗原或多肽可用于制备检测结核菌感染的试剂,此试剂可包含部分或全部蛋白质氨基酸序列。本发明所述抗原或多肽可用于制备结核亚单位疫苗或用于重组结核疫苗开发。本发明所述试剂可用于区分临床中不同类型的结核病,如单纯肺结核与肺结核合并支气管结核。
[0031]本发明所述结核分枝杆菌感染人群包括有临床症状的活动性结核病人和无症状的潜伏感染者。此处临床症状包括但不限于发热,咳嗽,胸痛,咳血,胸片异常等。
[0032]本发明所述释放Y干扰素的细胞包括但不限于T细胞和T细胞依赖性的可释放Y干扰素的细胞,如自然杀伤(NK)细胞。[0033]本发明所述T细胞包括但不限于⑶4+T细胞,⑶8+T细胞和YδΤ细胞。
[0034]一种体外检测结核分枝杆菌感染的方法,主要通过使用Rv0733抗原或多肽体外刺激T细胞,并检测释放Y干扰素细胞的数量或培养上清中Y干扰素含量,确定结核分枝杆菌的感染情况。
[0035]本发明还公开了一种新的检测结核分枝杆菌感染的方法,主要基于检测抗原特异性的抗体或抗原依赖性的Y干扰素等细胞因子的分泌量。
[0036]本发明公开了一种体外检测结核分枝杆菌感染的方法,通过ELISA的方法,检测结核病人或正常人外周血中本发明所述试剂的特异性抗体的含量,确定结核分枝杆菌的感染情况。
[0037]本发明公开了一种体外检测临床结核病特异性治疗效果的方法,主要通过使用Rv0733抗原或多肽体外刺激T细胞,并检测释放Y干扰素细胞数量或培养上清中Y干扰素含量,确定结核病人的临床预后情况。
[0038]此处检测方法包括但不限于:ELISP0T、ELISA、LUMINEX、细胞增殖、胞内染色和免疫杂交等。此检测方法中T细胞来源包含但不限于:血液、胸水、肺泡灌洗液、淋巴液及其它含有T细胞的生物样本。此检测方法中释放Y干扰素的细胞包括但不限于T细胞和T细胞依赖性的可释放Y干扰素的细胞,如自然杀伤(NK)细胞。
[0039]本发明实施方案之一中,采用ELISP0T(酶联免疫斑点检测,原理:用抗体捕获培养细胞分泌的细胞因子,并以酶联斑点显色的方式将其表现出来)的方法,检测活动期结核病患者外周淋巴细胞体外经本发明所述试剂刺激后Y干扰素对应的斑点数,每个斑点代表一个分泌Y干扰素的细胞,用以区分结核病患者和正常人;通过监测治疗过程中活动性结核病人的本发明所述试剂刺激`后的特异性刺激后释放Y干扰素的细胞数量,反映治疗的有效性,即预后情况。
[0040]本发明实施方案之二中,通过检测活动性结核病患者外周针对本发明所述试剂的特异性抗体水平,用以活动期结核病患者的血清学辅助诊断。
[0041]本发明实施方案之三中,通过用本发明所述试剂免疫小鼠,用ELISA的方法,检测体外经本发明所述试剂刺激外周血单个核细胞(PBMC)后的Y干扰素的释放量,和本发明实施方案之四中小鼠外周血血浆或血清中特异性抗体水平,反映出本发明所述试剂的免疫原性,用以将本发明所属试剂作为结核亚单位疫苗的前期实验阶段数据支持。
[0042]本发明所述试剂和方法能有效地检测活动性结核病人和潜伏感染者,并且操作简单,易于推广。
[0043]本发明的临床样本来自于结核病人和健康人群。基于全血(wholeblood)或用Ficoll密度梯度分离法获得外周血单个核细胞(PBMC)的Y干扰素释放实验。通过实验表明,Rv0733能很好的区分结核病人和正常人群,%%。
[0044]经过前期对结核分枝杆菌中表达的大量T细胞特异性应答的抗原筛选工作,本发明公开了一种试剂(Rv0733)和方法能很好的区分结核患者和正常对照人群,%%。并且本发明所述试剂和方法用于临床预后观察时,在治疗一个月后即有显著差异,P〈。小鼠实验(实施例3和实施例4)表明,本发明所述试剂能在小鼠体内同时诱导特异性T细胞应答和B细胞应答,预示其具有良好的疫苗开发潜力。[0045]用本发明所述试剂免疫小鼠后,小鼠能产生特异性的Y干扰素等细胞因子及抗体。利用本发明体外刺激结核病人或正常人群T细胞,检测其中Y干扰素释放细胞的数量或培养上清中Y干扰素含量,能区分出结核病人及正常人群;通过检测外周血清中抗本发明的特异性抗体的水平,可以提高结核病患者的检测灵敏度和特异性;利用跟踪结核病患者治疗过程中的Rv0733特异性免疫应答对比实验,本发明能揭示出结核病人的临床预后情况。
【专利附图】
【附图说明】
[0046]图1为本发明实施例1中Rv0733融合蛋白的SDS—PAGE示意图。
[0047]图2为本发明实施例2中结核病人及正常对照人群外周血PBMC中Rv0733特异性Y干扰素释放细胞数量比较示意图。
[0048]图3为本发明实施例2中治疗过程中活动性结核病人外周血PBMC中Rv0733特异性Y干扰素释放细胞数量的变化示意图。
[0049]图4为本发明实施例3中结核病人及正常对照人群外周血中Rv0733特异性抗体含量的示意图。
[0050]图5为本发明实施例4中经Rv0733抗原免疫二周后,小鼠外周血PBMC经Rv0733刺激后Y干扰素的释放量的示意图。
[0051]图6为本发明实施例5中经Rv0733抗原免疫二周后,小鼠外周血中Rv0733特异性抗体含量的示意图。
【具体实施方式】
[0052]以下通过具体的实施例进行示例,其中所用试剂均可通过市场渠道购买,如有未尽之处,可以参考相应的PCR和基因测序的实验手册。本发明所述实施方法,如无特别说明,均为常规方法。
[0053]实施例1:结核分枝杆菌Rv0733多肽及抗原的制备。
[0054]一、Rv0733融合蛋白(抗原)的制备实验步骤具体如下:
[0055],经测序后,,构建获得pET28a_Rv0733原核表达质粒。
[0056]-(DE3),构建表达工程菌。
[0057]°C,220rpm,诱导表达3h。
[0058]。
[0059]-NTA磁珠纯化获得Rv0733融合蛋白。
[0060](Pierce,23227)方法进行检测,并保存于一80°C冰箱。
[0061]-PAGE方法进行验证,结果见图1。
[0062],该Rv0733融合蛋白(抗原)的氨基酸序列从N端到C端如下:[0063]VRVLLLGPPGAGKGTQAVKLAEKLGIPQISTGELFRRNIEEGTKLGVEAKRYLDAGDLVPSDLTNELVDDRLNNPDAANGFILDGYPRSVEQAKALHEMLERRGTDIDAVLEFRVSEEVLLERLKGRGRADDTDDVILNRMKVYRDETAPLLEYYRDQLKTVDAVGTMDEVFARALRALGK,如SEQIDNO:1所示。
[0064]二、Rv0733多肽编号分别为从ADKO到ADK16多肽氨基酸顺序从N端到C端列于下,Rv0733多肽可用常规化学合成方法获得,该方法为行业内所熟悉。
[0065]ADKO:VRVLLLGPPGAGKGTQAVKL,如SEQIDNO:2所示;
[0066]ADKl:AGKGTQAVKLAEKLGIPQIS,如SEQIDNO:3所示;
[0067]ADK2:AEKLGIPQISTGELFRRNIE,如SEQIDN0:4所示;
[0068]ADK3:TGELFRRNIEEGTKLGVEAK,如SEQIDNO:5所示;
[0069]ADK4:EGTKLGVEAKRYLDAGDLVP,如SEQIDNO:6所示;
[0070]ADK5:RYLDAGDLVPSDLTNELVDD,如SEQIDNO:7所示;
[0071]ADK6:SDLTNELVDDRLNNPDAANG,如SEQIDNO:8所示;
[0072]ADK7:RLNNPDAANGFILDGYPRSV,如SEQIDNO:9所示;
[0073]ADK8:FILDGYPRSVEQAKALHEML,如SEQIDNO:10所示;
[0074]ADK9:EQAKALHEMLERRGTDIDAV,如SEQIDNO:11所示;
[0075]ADKlO:ERRGTDIDAVLEFRVSEEVL,如SEQIDNO:12所示;
[0076]ADKll:LEFRVSEEVLLERLKGRGRA,如SEQIDNO:13所示;
[0077]ADK12:LERLKGRGRADDTDDVILNR,如SEQIDNO:14所示;
[0078]ADK13:DDTDDVILNRMKVYRDETAP,如SEQIDNO:15所示;
[0079]ADK14:MKVYRDETAPLLEYYRDQLK,如SEQIDNO:16所示;
[0080]ADK15:LLEYYRDQLKTVDAVGTMDE,如SEQIDNO:17所示;
[0081]ADK16:TVDAVGTMDEVFARALRALGK,如SEQIDNO:18所示。
[0082]实施例2:ELISP0T检测Rv0733及其抗原肽刺激后的特异性Y干扰素释放细胞数量
[0083]实验步骤具体如下:
[0084]—Y抗体包被ELISP0T用96孔PVDF板(MiIliporeMSIPS4510),4°C过夜。
[0085],用含有10%FBS的RPMI1640于37°C封闭I小时。
[0086],柠檬酸钠或EDTA二钾抗凝管收集结核病患者或正常对照人群外周约5毫升。
[0087],lOOOXg,18-22°C,离心22min。分离获得外周血单个核细胞(PBMC)。
[0088]—IOmlPBS或RPMI1640洗涤2次并重悬于含10%FBS的RPMI1640中,计数,。
[0089],。实验孔中加入抗原或多肽,抗原或单条多肽终浓度为10μg/ml,多肽库中每条多肽终浓度为2μg/ml。,阴性孔加入相同体积的含10%FBS的RPMI1640。
[0090],37°C,5%CO2,100%湿度。
[0091]%Tween-20的PBS洗涤5次。每孔加入100μI生物素标记的IFN-Y抗体。用96孔板封口膜封闭各孔,37°C,孵育I小时。
[0092]%Tween-20的PBS洗涤5次,每孔加入100μI亲和素标记辣根过氧化物酶标记(HRP)。37°C,孵育I小时。
[0093]%Tween-20的PBS洗涤5次,每孔加入100μIAEC显色
液,室湿显色30分钟。
[0094]。并用蒸馏水洗涤5次,闭光于室温过夜凉干或37°C2-4小时烘干。
[0095],设置75μm为分界值。ROC曲线分析表明,%%。肺结核合并支气管结核病人外周血中Rv0733抗原特异性Y干扰素释放细胞数量比单纯肺结核病人显著增多。结果见图2a到图2c。利用多肽合成的方法,我们分析了ADK的T细胞表位分布结果见图2d。图2显示了结核病患者及正常对照人群外周血PBMCs中Rv0733特异性Y干扰素释放细胞数量和T细胞表位分布。其中,图2a显示了Rv0733融合蛋白体外刺激结核病人及正常人外周血PBMCs后IFN—Y斑点数比较,水平线代表mean土SD。图2b,的ROC曲线分析Rv0733区分结核病人与正常人的敏感性和特异性。图2c显示Rv0733融合蛋白体外刺激单纯肺结核及肺结核合并支气管结核病人外周血PBMCs后IFN—Y斑点数比较,水平线代表mean土SD。图2d是ADK抗原中T细胞表位分布图,水平线代表平均值。多肽序列为从N端到C端依次用化学方法合成,编号分别为从ADKO到ADK16。每条20个氨基酸,相邻二条间10个氨基酸重叠,最后一条即ADK16为21个氨基酸。SFU/250,000:每250000个细胞为斑点形成单位(spotformingunitper250,OOOcells)。AUC:曲线下面积(areaundercurve)。95%01:95%置信区间(confidenceintervalXP:假定值(Pvalue)。pulmonary:单纯肺结核病人。pulmonary/bronchial:肺结核合并支气管结核病人。errorbar:mean土SD。***:Ρ〈,*:Ρ〈。