文档介绍：基因工程(DNA重组技术):体外、定向、分子水平
基本工具:限制性核酸内切酶(限制酶)来自原核细胞,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
DNA连接酶: E·coliDNA连接酶(只黏性末端)
T4DNA连接酶(黏、平末端也可但效率低)
载体:质粒、入菌体的衍生物、动植物病毒
条件:①能在宿主细胞内稳定存在复制表达
②一种或多种限制酶切点
③标记基因(抗生素抗性基因、荧光基因)
基本操作程序:
1、目的基因的获取:(人工合成、体内提取)
①从基因文库获取
基因组文库
(部分基因文库)
大小
大
小
启动子
有
无
内含子
有
无
基因数目
某种生物全部基因
部分基因(基因选择性表达)
物种间基因交流
部分可以
可以(mRNA逆转录)
②PCR技术扩增目的基因:模板、Taq酶(热稳定DNA聚合酶)、原料&能量(dXTP)、引物(过量)
五物混合,加热至90~95℃,DNA解旋,冷却到55~60℃,引物与互补DNA链结合,加热至70~75℃,
Taq酶从引物起始互补链的合成
③人工化学合成:基因比较小,核苷酸序列已知
2、基因表达载体的构建:(基因工程的核心)
启动子:DNA片段,基因的首端,RNA聚合酶识别和结合的部位
目的基因
终止子:DNA片段,基因的尾端
标记基因:鉴别受体细胞中是否含有外源基因,从而将含有外源基因的细胞筛选出来。
(复制原点:仅自我复制的需要,整合到宿主染色体上再表达的不需要)
3、将目的基因导入受体细胞:
转化:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
(1)导入植物细胞(体细胞、受精卵)
①农杆菌转化法(双子叶植物、裸子植物)
受损,伤口细胞分泌酚类化合物,吸引农杆菌移向,Ti质粒上T-DNA(上插目的基因)转移至受体细胞整合到受体细胞染色体上
②基因枪法(单子叶植物)
③花粉管通道法
(2)导入动物细胞(受精卵)显微注射技术
(3)导入微生物细胞
优点:繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、对人体无害(大肠杆菌)
步骤:Ca2+ 处理细胞,使其成为感受态细胞,重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子
4、目的基因的检测与鉴定:
①DNA分子杂交技术:转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因(目的基因是否进入原核细胞)
转基因生物的染色体DNA(原核质粒)+有同位素标记的目的基因
②RNA分子杂交技术:目的基因是否转录出了mRNA 转基因生物的mRNA+有同位素标记的目的基因
③抗原-抗体杂交:目的基因是否翻译成蛋白质转基因生物的蛋白质+相应的抗体
④个体生物学水平的鉴定:抗虫抗病的接种实验
二、蛋白质工程(自然界不存在的蛋白质)
预期蛋白质功能,设计蛋白质结构,推测氨基酸序列,找对应的脱氧核苷酸序列,人工合成基因,基因工程,蛋白质产品
三、细胞工程:
(一)植物细胞工程:
1、植物组织培养技术:
(1)原理:植物体细胞的全能性
(2)过程:离体的植物器官、组织或细胞,脱分化(避光),愈伤组织(未分化,薄壁细胞),再分化,根芽,细胞分裂分化,植