文档介绍：实验六氨基转换作用
目的要求:了解转氨酶在代谢过程中的重要作用
学习应用纸层析法鉴定氨基转换反应
实验原理
体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转换酶的作用下,移换至α-酮酸的过程,称氨基转换作用。
转氨酶(aminotransferase)
转换酶中的一类。催化氨基酸和a-酮酸或醛酸之间的氨基转换反应,生成与原来的a-酮酸或醛酸相应的a-氨基酸或ω- 氨基酸,原来氨基酸转变成相应的酮酸。转氨酶催化的反应都是可逆的。
转氨酶参与氨基酸的分解和合成,是人体代谢过程中必不可少的“催化剂”;
以谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)最为重要。
GPT 主要存在于肝脏、心脏和骨骼肌中,在肝脏中活力最大。GPT升高是肝脏功能出现问题的一个重要指标。
本实验是将谷氨酸与丙酮酸在肌肉糜中谷氨酸-丙酮酸氨基转换酶(简称谷-丙转氨酶)的作用下进行氨基转化反应,然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。
谷丙转氨酶
L-谷氨酸
丙酮酸
α-酮戊二酸
L-丙氨酸
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在反应体系中添加溴乙酸以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。
谷氨酸、丙酮酸(丙酮酸羧化酶系)--糖异生途径
谷氨酸、草酰乙酸在谷草转氨酶(GOT)催化转氨基生成天冬氨酸。
丙酮酸:丙酮酸脱氢酶系催化生成乙酰辅酶A,进入TCA循环。
试剂和器材
试剂
1%谷氨酸溶液(用1% KOH调到中性);1%丙酮酸钠溶液(用1% KOH调到中性);%KHCO3溶液;% 溴醋酸溶液(用1% KOH调到中性);2% Hac溶液;%标准谷氨酸;%标准丙氨酸。
展开剂:酚饱和水溶液:2份酚加1份水混合放入分液漏斗,振荡。静置24小时
显色剂:%茚三酮正丁醇溶液。
材料
肌肉糜:取兔子肌肉1g,置研钵中,% 氯化钠溶液3ml,在低温下研磨成细浆,离心5分钟(3000转/分),弃去沉淀,得肌肉糜提取液。
操作方法
一、转氨酶作用
1、取试管2只编号(1、2), 1%谷氨酸溶液, 1%丙酮酸钠溶液, % %溴醋酸, 混匀。,混匀,将其中一试管立即在沸水浴中加热2-3分钟做对照。用试管帽塞住另一只试管,置于45℃水浴中保温40min。
2. 保温完毕,取出试管。向每只试管中各加2% HAc溶液4滴,再置于沸水浴中2min,使蛋白质完全沉淀。过滤收集滤液待用。
二、层析验证
1. 取9厘米培养皿一个,,取圆形滤纸一张,在中心剪一直径约2mm的小孔,并以圆心约1cm为半径划一圆作为底线。在此底线上,用铅笔点四个等距离的原点并标明1,2,3,4;
2. 用毛细管分别吸取以上两种滤液及标准谷氨酸、丙氨酸,依次点在标明号码的原点处,点样2-3次。注意斑点不能太大,。
,直径约2~3mm,将此小筒插入滤纸中心小孔(不可突出纸面之上),使层析滤纸通过此小筒与酚溶液相连。然后将滤纸平放在盛饱和酚的培养皿上。另取一大小相同的培养皿盖在滤纸上,此时酚溶液即由滤纸中心孔向四周扩散。