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关键词：羧肽酶 B, carboxypeptidaseB, 碱性峰来源：雅心生物
羧肽酶 B (EC )专一用于蛋白质 C-末端碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）的水解；又称为肽酰-L-赖氨酸（L-精氨酸）水解酶；精蛋白酶。分子
量为 35kD，等电点为 ，最适 pH为 7-9。羧肽酶 B 是抗体碱性峰检测的特异酶，通过比较酶切前和酶切后的图谱来计算抗体碱性变体的比例，对于抗体的发酵工艺和纯化工艺稳定性的控制都具有重要的意义。
而在抗体碱性峰的检测中，没有完全统一的标准，如酶解缓冲液酶的用量，酶解时的温度和时间等。而这些与酶的性质密切相关。
可以选择的羧肽酶 B 有两种，一种是动物胰腺提取的羧肽酶 B，一种是基因工程的重组羧肽酶 B，前者由于胰腺中含有各种蛋白酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶等，常常不能彻底去除，在酶切时会有非特异的酶切杂峰出现，影响结果判断。后者为基因工程生产的，成分单一，无杂酶，比活高，应用上更有优势。
羧肽酶 B 的结构
天然存在的羧肽酶 B 是由前羧肽酶原 B（preprocarboxypeptidaseB，preproCPB）经酶解产生，后者 N-末端包含 108个氨基酸（其中 13个氨基酸为信号肽序列，95个氨基酸组成前导肽部分）的多肽片段与CPB 相连。前羧肽酶原B 在转运到
内质网的过程中，信号肽被切掉，得到无酶活性的羧肽酶原 B
（procarboxypeptiedaseB, proCPB）并从细胞中分泌出来，最终在小肠中经胰蛋白酶在 Arg-95处酶解，成为具蛋白酶活性的 CPB。proCPB的分子量为 46kD，
由 401个氨基酸组成；CPB 分子量为 35kD，由306个氨基酸组成（如图1）。在 CPB 中，前体的活化主要依赖胰蛋白酶在 Arg95位的切割，半球形前导肽被切
割后，它既不会抑制酶体，也不再与之结合，这使得酶体能迅速发挥功能，并对前导肽 C-端的 Arg进行切割。
图 1 羧肽酶原B 的三维结构及其激活部位示意图
（上面暗红色部分代表前肽，下面蓝色部分代表羧肽酶B，箭头所指为胰蛋白酶酶切激活位点）
羧肽酶 B 的性质
取重组羧肽酶 B 冻干粉，纯度见图 2。研究了重组羧肽酶 B 的最适 pH，最适温度，pH稳定性及温度稳定性，对于CPB 的使用起到指导作用。同时做了溶液的反复冻融稳定性，对于 CPB 酶液的储存和使用起到指导作用。
图 2 纯化后重组羧肽酶B 的电泳分析
1、羧肽酶B 的 pH稳定性
将纯的重组羧肽酶 B 用纯水溶解为 10mg/ml，之后用以下缓冲液稀释使酶液
的终浓度为 1mg/mL，pH分别为 、、、、、、、、、、、、， 25℃孵育 12h后测活。结果见图 3（左）。
2、羧肽酶B 的最适 pH
测定 rCPB 纯酶液浓度为 1mg/mL,在不同 pH条件下的催化速率，底物浓度
为 ，pH分别为 、、、、、、、、、、、、、，- 50mMNaAc-HAc缓冲液配制，- 50mM
KPB 磷酸盐缓冲液配制， - 50mMTris-HCl 缓冲液配制，- 50mMGly-NaOH缓冲液配制。结果见图 3（右）。
图 3rCPB 酶液的pH稳定性（左）和最适反应pH （右）
CPB 在 -，25℃孵育 12h无活性损失；最适 pH表明，
在 ，-。在 pH≤7和 pH≥10时，基本无
活性。
3、羧肽酶 B 的温度稳定性
将 rCPB 酶液配成浓度为 1mg/mL，置于 4℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃条件下，每个温度三个平行，时间定为 15min、30min、1h、2h、4h、8h、
20h分别取样测定其活性，以初始时酶活定为 100%，以残余酶活百分比表示测
定结果。
4、羧肽酶B 的最适催化温度
在不同温度下恒温水浴测活底物，使底物的温度分别为 4℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，取适量rCPB 纯酶液，测定活力。以254nm吸光值 OD254为纵坐标，时间为横坐标，结果表示见图 4（右）。
图 4 rCPB 酶液的温度稳定性（左）和最适催化温度（右）
CPB 在 40℃以下保温 10h，均活性稳定。最适催化温度显示，在 3min 内，40℃以下均可保持良好的线性，其中，以 25℃为最佳。
5、羧肽酶B 酶液的反复冻融稳定性
将 rCPB 酶液反复冻融，测定每次冻融后的酶活，计算活力保留率，得到同一管 rCPB 反复冻融 10次后的活力稳定性（如图 5）。
图 5 rCPB 酶液的反复冻融稳定性
结果表明重组羧肽酶 B 反复冻融稳定性好。经过 10次的反复冻融，几无活性损失。