文档介绍：实验六还原糖和总糖含量的测定(3,5-二硝基水杨酸比色法)
目的
通过本次实验,掌握还原糖定量测定的基本原理,学****比色定糖法的基本操作,熟悉分光光度计的使用方法。
原理
还原糖是指含有自由醛基或***基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖。乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法,其基本原理是用比色法对还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。
在碱性条件下,还原糖与3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS)共热,3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质),还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系,在540nm波长下测定棕红色物质的吸光值,查对标准曲线并计算,就可以分别求出样品中还原糖和总糖的含量。
管号
0
1
2
3
4
5
6
葡萄糖液(ml)
0

蒸馏水(ml)

DNS试剂(ml)

加热
同时一起在沸水浴中加热5min*
冷却
立即用流动冷水冷却至室温
蒸馏水(ml)

吸光值(A540)
操作步骤
1、绘制葡萄糖标准曲线
将以上各管上下颠倒几次使溶液混匀后,按顺序倒入比色杯中,在540nm波长条件下进行比色测定:用0号管溶液调零点,分别记录各管吸光值;然后以葡萄糖浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制出标准曲线。
2、测定样品中还原糖和总糖含量。
(1)提取样品中的还原糖:
准确称取1g食用面粉放置于100ml三角瓶中,加少量蒸馏水调成糊状,再加入50ml蒸馏水,摇匀,置于50℃水浴条件下20分钟,使还原糖浸出;在4000rpm、5分钟条件下进行离心,得到的上清液倒入100ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,上下颠倒几次将溶液混匀,作为还原糖待测液。
(2)提取样品中的总糖:
,加入10ml 6mol/L HCl及15ml蒸馏水,沸水浴30分钟(注意不能把水烧干)。用滴管吸取1~2滴水解液于白瓷板上,加1滴I-KI溶液,如显示出蓝色说明水解不完全,可适当延长沸水浴时间;若不显蓝色,则说明水解完全。
待水解液冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂,用6mol/L NaOH中和至微红色,在4000rpm、5分钟条件下离心,得到的上清液转移到100ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,上下颠倒几次混匀溶液,作为总糖待测液。