文档介绍：Part I T细胞表型测定(一)
Part II 小鼠脾细胞分离技术
实验一
潍坊医学院免疫学教研室
林志娟
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Part I T细胞表型测定(一) ---免疫细胞的分离、细胞涂片、固定及保存
【原理】
T细胞是一个复杂的,不均一的整体,根据其发育的不同阶段,表面标记以及功能,可将其分为不同的亚群。T细胞介导细胞免疫应答,并且对B细胞介导的体液免疫应答起到辅助和调节作用。
T细胞表面标志的检测,有助于了解机体的细胞免疫功能,对免疫缺陷病、肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、移植排斥反应等疾病的诊断、分型、预后和疗效观察有着重要的意义。
共有标志:CD3+--总T细胞
特有标志:CD4+T细胞--辅助细胞,
CD8+T细胞--杀伤细胞。
T淋巴细胞表面标志
外周血正常值
CD3:60~80%;CD4:35~55%;CD8:20%~30%
CD4/CD8:~
CD4/CD8<:
①免疫缺陷病,如艾滋病≤;②恶性肿瘤;
③再生障碍性贫血;④某些病毒感染。
CD4/CD8>:
①自身免疫性疾病,如SLE、类风湿关节炎等。
SABC-AP法测定T细胞亚群
SABC:链酶亲和素-生物素
链酶亲和素:一种糖蛋白,可由蛋清中提取。分子量60kD,每个分子由4个亚基组成,可以和4个生物素分子结合。亲和素与生物素一经结合就极为稳定,形成一种类似晶格的复合体。
AP:碱性磷酸酶。
酶标生物素+ 亲合素 A+B
T cell
待测T细胞
CD分子(???)
一抗
二抗
(碱性磷酸酶的)底物
实验基本流程
间接SABC-AP法 ---- T细胞亚群检测
淋巴细胞+小鼠抗人CD3/CD4/CD8分子单克隆抗体(一抗)
二抗(生物素化)
标有AP的SABC
酶底物显色剂(BCIP/NBT)
酶将底物催化显色,阳性细胞膜上显色。
此为间接法。
直接法:不用二抗,将SABC物直接标记于一抗。(一抗价格昂贵)
SABC系统对抗原抗体反应起到放大作用,提高反应的敏感性。