文档介绍：第八章聚合酶链反应
1985年PE-cetus公司的人类遗传研究室Mullis等人发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)。此技术能够特异地扩增任何所希望的目的基因或DNA片段。在基础和临床医学、法医、考古等方面有重要的应用价值,并对分子生物学技术的发展给予巨大的推动。
第一节 PCR原理与特点
第二节 PCR类型
第三节 PCR技术在医学上的应用
一、PCR的基本原理
在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件——模板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等,使目的DNA得以迅速扩增(图8-1)。
㈠ DNA模板变性
双链DNA是通过94℃左右的高温使其发生变性,形成单链DNA。
㈡模板与引物退火
将合成的两个寡核苷酸引物分别与待扩增DNA两端的序列互补。通过控制退火条件,引物就能准确地与扩增区域的两端配对。
㈢引物延伸
在4种dNTP底物及Mg2+存在条件下,DNA聚合酶在最适作用温度可将单核苷酸从引物3′端掺入,沿模板延伸合成新股DNA,每一循环的产物可作为下一循环的模板。
以上所述的变性、退火、延伸“三步曲”被确定为PCR的一轮循环,整个PCR过程一般需进行三十轮的循环。
按2n的指数方式递增, PCR扩增量应达到230个拷贝, “平台效应”出现的迟早主要取决于起始模板的拷贝数、所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的浓度等多种因素。
二、PCR技术的特点
㈠高度的敏感性
PCR产物的生成是以指数方式增加的,即使按75%的扩增效率计算,单拷贝基因经25次循环后,其基因拷贝数也在100万以上,即可将极微量(pg级)DNA扩增到紫外光下可见的水平(g级)。
㈡高度的特异性
PCR扩增的特异性在很大程度上依赖于引物与模板的互补程度,即引物与模板结合的正确性。
㈢操作简便、快速
㈣适用样品广泛
含微量(pg、ng)目的DNA或RNA的样品即可用作反应的起始材料。
三、常规的PCR操作
㈠反应体系
标准PCR反应体积为50~100l,其中含有:1PCR反应缓冲液、四种dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、二种上、下游引物、DNA模板、Taq DNA聚合酶。
㈡反应步骤
四、PCR反应条件的优化
㈠模板核酸
PCR可以用DNA或RNA模板材料。但用RNA模板的扩增需首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环。
㈡引物
引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸,两段引物分别与相应的一条DNA链3’端及5’端互补。
引物设计一般遵循下列原则:
(1) 引物的序列应选定基因组DNA的高度保守区,以减少引物与基因组的非特异结合,提高反应的特异性。
(2)   引物的长度以15~40bp为宜。
(3) 引物的碱基尽可能随机分布,避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列,G+C碱基的含量在40%~75%之间。
(4) 引物内部应避免形成二级结构,特别是引物的末端应无回文结构。
(5) 二个引物之间不应有互补序列,以免形成“引物二聚体”,浪费引物。
(6) 引物5′末端碱基无严格限制,在与模板结合的引物长度足够的条件下,其5′端碱基互补程度无严格限制。
(7)   引物3′端的头1~2个碱基会影响Taq DNA聚合酶的延伸效率,从而影响PCR反应的扩增效率及特异性,因此选择合适的3′端碱基很重要。最好选T、C、G,不选A
(8) 引物的3′端应为保守氨基酸序列,即采用简并密码少的氨基酸如Met、Trp,且要避免三联体密码第3个碱基的摆动位置位于引物的3′末端。
㈢耐热DNA聚合酶
Taq DNA酶有良好的热稳定性,Taq DNA聚合酶在70~75℃时具有最高的生物学活性。
㈣脱氧核苷三磷酸
脱氧核苷三磷酸(dNTP)是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的总称,是靶DNA序列扩增的原料。dNTP浓度取决于扩增片段的长度、MgCl2浓度、引物浓度等反应条件。
㈤缓冲液
目前最为常用的缓冲液体系为10~50mmol/L Tris-HCl (pH ~,20℃)。
㈥ Mg2+
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降;Mg2+浓度过高则影响PCR反应的特异性。