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1 ,211 3 采克俊 于立颖 刘 莉
( )1 湖州师范学院生命科学学院 313000 2 扬州大学动物科学与技术学院 225009 【摘要】睾丸组织移植是将同种或者异种供体的睾丸组织移植到受体的皮下 、腹腔等血管丰富的部位后 ,检测移 植物生长发育和精子发生情况 。利用睾丸组织移植的方法来加速供体睾丸细胞的分化与增殖 ,在较短的时间内得 到大量的生殖细胞 ,这对于种质资源保存 、精子发生研究和男性不育症的治疗都是一有效的技术手段 。本文对睾丸 组织移植的供体选用 、受体准备 、移植的部位 、移植物处理和检测以及移植技术的应用作一综述 。
关键词 : 睾丸组织 ;移植 ;精原干细胞
相对于“基因库”而言 “, 基因组库”保存了各种组织 、精 1 . 2 供体睾丸的成熟性 子 、胚胎和 卵 巢 组 织 , 但 在 雄 性 遗 传 物 质 的 保 存 上 还 较 少 。 在睾丸组织移植中 ,一般选用各种动物的未成熟睾丸组 由于精子本身不可自我复制 ,所以就光保存成熟的精子 ,以 织作为供体 ,其理论基础是未成熟的组织具有较低的免疫原 后产生的后代会逐渐减少 。而且许多珍稀动物的生存力都性 ,种植于受体内可存活并可正常发育 ,具有内分泌功能 ,能
比较弱 ,如果在性成熟之前就死亡 ,那么这些个体的遗传物 够分泌足够的睾酮 。而在成熟睾丸组织作为供体的研究中 , 〔1〕质就会丢失。通过睾丸组织移植技术 ,就不仅可以保存生 虽然移植物中发现有精子存在 ,但是不能确定是原有精子的 〔6〕殖细胞及生育能力 ,同时为研究生精过程调控因子提供了一 残留物 还 是 移 植 后 生 精 过 程 部 分 恢 复 而 产 生 的。Geens〔8〕条新途径 。 等将成年人的睾丸组织移植到 SCID 小鼠的皮下 ,只发现 睾丸组织移植发展至今已取得很大进展 ,同种移植 、异 有人类精原干细胞的存活 ,并没有完整的精子发生 。这可能 种移植以及最新的异源睾丸组织移植 ,一个又一个的突破不 是物种跨距太大 ,当然也有可能是因为成熟的睾丸组织中恢 〔6〕 断推动这门技术向前发展 。睾丸组织移植不仅技术简单 ,有复生精的能力较弱 。Schlat t 等比较了小鼠的新生睾丸和 效性高 ,而且弥补了差异较大的物种之间精原干细胞移植缺成熟睾丸作为供体的移植情况后提出 ,未成熟睾丸组织移植 陷 ,克服了由于物种差异大而不产生完整精子发生过程这一 物发育优于成年睾丸组织移植物发育 ,可能是因为未成熟供 难题 。睾丸组织移植后能加速供体睾丸细胞的分化与增殖 , 体中的间质细胞重建间质组织的能力远远大于成年供体 。 〔2〕 使得跨物种 的 精 子 发 生 成 为 可 能, 同 时 也 为 种 质 资 源 保2 受体的准备 存 、精子发生研究和男性不育症治疗等方面提供了一条有效 2 . 1 受体的免疫状况的途径 。以 下 就 对 睾 丸 组 织 移 植 的 几 个 关 键 点 , 即 供 体 选 除了自体移植之外 ,在睾丸异体组织移植中 ,往往都要 择 、受体准备和移植物检测等方面作一综述 。求受体动物无免疫能力 ,因为具有免疫缺陷性的受体更易模 1 供体的选择 〔9 ,10〕仿生精细胞在体内发育的微环境 。Ho naramooz 等分别 1 . 1 供体的种类将新生小鼠 、猪和山羊睾丸组织 ,埋植于去势 SCID 小鼠背部 〔3〕Alt wein 等在 1972 年首次对睾丸 组 织 移 植 进 行 了 探 皮下 ,并不给予任何外源性激素 ,观察其生长发育情况 。结 索 ,他将成年鼠的完整睾丸移植到近交系成年受体鼠的腹股 果显示 ,3 种不同睾丸组织均可在小鼠体内存活 ,而且能产生 〔11〕沟皮下 ,10 周后发现移植物都化脓 ,所以该作者认为睾丸种 有功能的精子 。于洁等对新生小鼠睾丸组织移植到裸鼠 植是不能存活的 。但是随后的研究证实睾丸移植可以在异 背部后 ,不同 时 期 移 植 物 的 存 活 和 生 长 情 况 作 了 系 统 的 研 体 中 存 活 , 而 且 可 以 使 去 势 受 体 的 激 素 水 平 恢 复 正 常 。究 ,得到移植物的总回收率达到 90 . 0 % ,重量比移植前增加 〔4〕Ho naramooz 等将新生小鼠 、猪 、山羊的睾丸组织碎片移植 约 40 倍 ,移植物中生精小管发育以及各阶段生精细胞出现 ) ( 到去势的 SCID 严重联合免疫缺陷小鼠背部皮下 ,观察到 时间与正常小鼠基本相同 。由此可见 ,睾丸组织移植比生精 至少有 60 %的移植物存活并最终产生成熟的 、功能正常的精细胞移植的操作更方便而且有效性高 。尤其对那些大型哺 子 。迄今为止 ,除了白臀野牛 、狨猴等少数物种外 ,其他物种 乳动物 ,由于受到受体体内激素分泌的影响 ,移植到成年小鼠 如小鼠 、仓鼠 、猫 、兔 、猪 、山羊和牛等的未成熟睾丸组织移植 体内的睾丸组织成熟时间以及精子发生都明显提前 。因而大多 〔5 ,6〕到小鼠体内 ,均发现了完整的生精过程。Dobrinski 对各 数的睾丸组织移植都选用 SCID 小鼠或者裸鼠作为受体 。 〔7〕种物种的睾丸组织移植成果进行了总结,见表 1 。 但是 SCID 小鼠极易感染 ,即使在高度洁净的 SPF 环境 〔7〕 ( )表 1 睾丸组织移植总结受体一律采用 SCID 小鼠 下也只可存活约一年左右 。对于饲养 SCID 小鼠有困难的实 供体 精子发生 备注 验室 ,也可选用同种动物来作为受体 ,由于其他受体都存在
( )完全 得到供体后代 一定的免疫抑制性 ,因而需要注射一定量的免疫抑制剂来减 小鼠 异体异位移植
大鼠完全 弱受体的免疫反应 。这在精原干细胞的移植上常选用环孢 ( ) 得到供体后代 兔 非异位移植完全 ( ) ( ) 素 A CsA和雷怕霉素 Rapamycin等免疫抑制剂 。在睾丸 〔12〕猪 山完全 得到胚胎 回组织移植上这方面研究较少 , So ng 等将新孵化雏鸡的睾 羊 ,绵羊 完全 收到精子 丸移植到不同品系的新生受体鸡中 ,然后以每天 100 mg/ kg 完全效率很低奶牛( 的量给 受 体 鸡 注 射 免 疫 抑 制 剂 mycop henolatemofetil , Cell2猫 马 完全 回收到精子 〔13〕) Cep t,连续注射 2 周 ,获得较为理想的效果 。许迎科等将 猕猴 完全 效率很低 得幼年羊的睾丸组织块移植到小鼠背部皮下 ,同时用环孢素 A 白臀野牛 完全 到胚胎 ( ) CsA抑制受体小鼠的免疫功能 ,发现添加 CsA 组与不添加( )发现减数分裂的细胞 人类 成年 组的移植试验结果无显著差异 ,移植组织虽然明显增大 ,但 精原干细胞存活 没有出现精子发生 。该作者认为单纯使用一种免疫抑制剂
CsA 也许并不能完全抑制机体的免疫能力 ,也可能是由于受 3 为通讯作者 。 体体内的激素环境等阻碍了移植组织的进一步分化 。 ( ) 基金项目 :国家自然科学基金 30500270, 浙江省科技攻关重 2 . 2 受体的去势处理( ) ( ) 点计划项目 2005C22052, 浙江省自然科学基金 Y304194, 湖州 ( ) 在睾丸组织移植研究中 ,大多数采用去势雄性动物作为市自然科学基金 2006 YZ08。
〔5,8〕受体。这是由于高浓度的促性腺激素对移植物的生长 势雄性小鼠中移植的新生小鼠睾丸组织生长和发育进 〔18〕发育起支持作用 ,所以阉割动物比正常的成年动物更适于作 提出同种移植睾丸组织中支持系统分析 。谭付清等〔14〕受体。在将猕猴的睾丸组织移植到小鼠皮下的实验中 , 数目的减少和萎缩及其胞突构成的紧密连接出现断裂 移植组织在完整小鼠中并没有生长的迹象 ,因此认为要促使 是植睾生精功能不良的主要原因 ,同时也提出 GDN F 的 〔15〕睾丸移植组织的生长 , 必须先将受体小鼠去势。同时也 水平可作为睾丸生精功能状态指标之一 。 有移植到雌性小鼠作为受体的 ,移植物同样也能存活 ,产生 正常精子 ,因此认为受体性别对移植物的存活率和生精细胞 5 . 2 人工辅助生殖产生后代〔16〕发育没有显著影响。由此可见 , 在选用受体时可尝试采 将睾丸组织移植后 ,由于移植物中不存在输出小用雌性受体 ,则省略了将雄性受体阉割这一步骤 ,使操作得 而管腔液会积聚在生精小管腔中 ,从而破坏生精小管上 以简化 。 构 ,所得到的精子数量会比自然的少很多 ,这就要求从 3 睾丸移植的部位 物中获取精子的时间要选用在精子生成并且管腔液积 睾丸移植的部位广泛 ,一般应选在受体血管组织较为丰还不至于严重破坏生精上皮结构的时刻 ,因而 ,在移植 富的区 域 , 如 大 腿 浅 肌 层 、颈 部 皮 下 或 肾 被 膜 下 等 。鲁 波 中得到的精液往往要比自然得到的少很多 。要用有限 〔16〕等对新生大鼠睾丸组织移植后的情况进行了研究 。他们 子繁殖出后代 ,需要采取一定的人工辅助生殖的手段 。 把新生大鼠的睾丸组织块 ,移植于成年去势大鼠的大腿内侧对于哺乳 动 物 主 要 采 取 单 精 子 显 微 注 射 技 术 的 〔4 ,15〕深筋膜和肌膜之间 。通过肉眼观察发现 ,深筋膜处的血管和 Ho naramooz 等将猪 、山羊等物种的移植睾丸中得到肌膜处的血管向移植物爬行 ,并在其表面连接成网络状 ,每 ) (子进行 ICSI 卵母细胞单精子显微注射技术成功得到 个移植物表面均有 2,3 根较粗的小血管 。移植后的组织为将恒河猴的移植睾丸中取得的精子也通过单精子显微 摄取一定的养分 ,在其表面会形成血管 。观察移植物表面是得到了恒河猴的桑椹胚时期的胚胎 。而对于鸟类来说 , 否有血管生成 ,也可用于初步判断其是否存活 。生理构造与 哺 乳 动 物 差 异 很 大 , 单 精 子 注 射 的 可 操 作 〔12〕在所有鼠 - 鼠移植中 ,无论移植部位在背部皮下 、腹部 低 ,因此主要选取人工授精的方法 , So ng 等将鸡的移皮下或睾丸软组织内 ,未成熟睾丸组织均可与受体建立良好 丸中得到的液体通过输卵管壶腹部深部注射辅助受精 的关系 ,发育出连接受体和移植物的血管组织 ,保证生精细法得到了正常的小鸡 。 〔2〕 胞继续生长发育 ,完成整个生精过程最后形成精子。So ng6 睾丸组织移植的应用 〔12〕 等摸索了用鸡作为睾丸组织移植受体的效果 。将新孵化 6 . 1 种质资源保存() B PR 鸡 Barred Plymout h Rock chicks的睾丸移植入新 生 莱 与传统的精液冷冻相比 ,冷冻睾丸组织可保存大量 ( ) 杭鸡 White L egho n chick腹腔 、腹部皮下以及背部皮下 ,均 性生殖细胞 。许多濒危动物未到性成熟年龄就已夭折 , 产生有活力的精子 ,并且通过辅助生殖技术 ,得到了供体鸡还没有达到性成熟的年龄 ,因而通过保存精液的方法来 的后代 。另外还比较了腹腔 、腹部皮下和背部皮下这三个部 种质资源是不可能的 。而通过睾丸组织冷冻技术与移 位的移植组织生精情况 ,发现腹腔移植组织块的生长发育及 术相结合的方法 ,即先将濒危物种未成熟睾丸组织冷冻 生精情况都较为理想 。起来 ,在需要时把复苏的组织移植到适合的受体体内 , 4 对移植物的处理 植的睾丸组织重新生成精子 ,就可以达到重建濒危物种 〔2〕 4 . 1 直接移植 发生的目的。对于转基因动物 、变异动物和克隆动物 一般睾丸移植都采用直接移植的方法 。取出的睾丸在命力很弱的个体 ,同样可以采用睾丸组织移植的手段得 冰面上剥除睾丸被膜 ,用生理盐水冲洗睾丸实质后切分成小 子 ,这无疑为遗传学家研究生殖细胞的发育提供了新方 〔5〕块移植于受体,也可置于青霉素链霉素的磷酸缓冲液中剥 6 . 2 精子发生研究〔10〕除被膜后移植。如果不是立即移植 , 则需将移植组织置 一般哺乳动物的性成熟时期较长 ,比如猪性成熟需 〔12〕于 DM EM 培养液中 ,在 4 h 以内完成移植。 ,5 个月 ,羊需要 5,10 个月 ,恒河猴需要 3,4 年 ,而人 4 . 2 冷冻保存性成熟时间就更长 ,大约需要 12,14 年 ,哺乳动物的性 睾丸组织的冷冻相对于细胞冷冻要较为复杂 ,因为冷冻 时期如此之长 ,使得研究睾丸成熟和生精过程的调控机 〔4〕时需要考虑到其中不同细胞的冷冻耐受性以及冷冻剂能否 难重重 。Ho naramooz 等用小鼠作为受体 ,将猪和山羊〔6〕迅速渗透高度致密组织等问题,选用适合的冷冻剂是组织 丸组织移植到小鼠体内 ,在 4 周时就发现有完整的精子 〔17〕冷冻的关键问题 。Milazzo 等在比较不同冷冻剂的效果时 过程 。该作者也采用同样的方法将恒河猴的睾丸组织 〔15〕发现 ,对于 6 日 龄 的 小 鼠 睾 丸 组 织 来 说 , 浓 度 为 1 . 5 M 的 到小鼠体内 ,在 7 个月时发现有成熟精子产生。由) (DMSO 二甲基亚砜对于睾丸组织的冷冻效果较好 ,新生睾 见 ,将睾丸组织移植到小鼠体内的方法大大促进了睾丸 丸组织结构 、睾丸细胞功能 、内分泌以及部分外分泌的功能 熟 ,这为研究哺乳动物的生精过程提供了一条有效的途 〔4 ,9〕都得以 较 好 的 保 存 。Ho naramooz 等将 猪 、未 成 熟 小 鼠 、 6 . 3 男性不育的治疗仓鼠和成年小鼠的睾丸组织冷冻后再移植到免疫缺陷的宿 对于性未成熟的男性癌症患者 ,通过化疗等治疗癌 〔14〕 主体内 ,发现有精子发生和类固醇形成 。另外 , Howell 等手段会使其丧失生育能力 ,为了使这些人拥有属于自己 将兔的冷冻睾丸碎片移植到 SCID 小鼠体内后 ,也观察到正 一代 ,可以通过两种方法来恢复他们的生育能力 ,一是 常的精子发生过程 。该方法为濒危物种保持生育能力开辟 治疗前自体的生殖细胞 ,在需要的时候移植到生精小 了一条新的途径 。二是冷冻保存患者治疗前未受损伤的睾丸组织 ,在治疗 5 对移植物的检测 用移植的方法重建生精过程 。这两种方法都能使癌症
5 . 1 存活率及生长状况的检测后的男性成功恢复生育能力 ,但移植自身生殖细胞的方 移植组织 存 活 率 的 统 计 、切 片 观 察 精 子 细 胞 的 出 现 情 到的干细胞数量较少 ,而且所移植的细胞可能会受到癌 况 、生精细胞的退化和脱落以及生精小管的生长等方法都可 扩散的影响丧失生命力 。使用睾丸组织冷冻的方法得 〔12〕用于睾丸移植组织的检测 。So ng 等通过比较睾丸在不同 生殖细胞大 大 增 多 , 并 可 避 免 恶 性 肿 瘤 转 移 等 所 带 来 〔3〕部位移植的存活率判断出腹腔内是最适合小鸡睾丸移植的 题 ,在需要时结合辅助生殖技术就可得到健康的后代〔11〕部位 。于洁等通过测量不同发育时期移植物的重量 , 并 7 展望 用切片观察其中生精小管结构和生精细胞的组成情况 ,对去至今 ,睾丸组织移植已经获得一定的成果 ,特别将
熟的睾丸移植到 SCID 小鼠体内 ,大多数物种的睾丸组
( )王莉兴 鲁绍雄 云南农业大学动物科学学院 云南 昆明 650201
β,直接关系到 猪的产仔数是繁殖性状中重要的经济性状 致 。研究证实 ESR 、FSH基因是影响产仔数的两个主效基