大肠杆菌感受态细胞的制备与转化.ppt

文档介绍：实验七
大肠杆菌感受态细胞的
制备与转化
1、学习掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法
2、学习和掌握热激法转化大肠杆菌的原理和方法
3、把实验六连接反应产物进行转化实验
实验目的
1)相关名词概念
将质粒导入大肠杆菌或其它细胞内的过程叫作转化。
与噬菌体不同,质粒本身不具备感染细胞的能力。为了使细胞能吸收外来DNA,必须改变其细胞生理状态,使之具有很高的接收外源DNA的能力,这种具有接收外源DNA能力的细胞叫感受态细胞。
2 ) CaCl2- 热激法转化原理
CaCl2能改变细胞膜的通透性,大肠杆菌经低渗CaCl2溶液致敏处理,就变成高效的感受态细胞;感受态细胞与质粒混匀于0℃时,混合物中的DNA形成抗DNase羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面,再经42 ℃短时热激时进入细胞内实现转化,利用质粒上的遗传选择标记在LB平板上进行初步筛选转化菌落。
实验原理
1、材料
菌株: TOP10
质粒:pBI121-chs(实验六连接反应产物)
2、试剂
LB液体培养基、LB/Amp(100ug/mL)固体培养皿、 CaCl2、灭菌去离子水
试剂与器材
实验步骤
(一) CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞
1)挑取纯化的大肠杆菌TOP10单菌落接种于盛有5 mL LB液体培养基的小三角瓶里,37℃,180rpm振荡培养过夜;
2)取1 mL培养菌液接入100 mL液体培养基中,37℃ -,冰浴15min;
3),4℃,4000rpm离心5min,弃上清, CaCl2 (过滤灭菌)悬浮,用枪头轻轻混匀,冰浴15 min;
4)4℃,4000rpm离心10min,弃上清, CaCl2,轻轻重悬,~5小时后,即可用于转化;或每管加灭菌甘油至终浓度15%,混匀,液氮冷激后置于-70℃冰箱保存。
(二) TOP10
1)将连接产物10μL转移至装有200μL感受态细胞的