文档介绍：生长激素饮料
与
基因工程
2011级一系一班
贺娟
2011221976
一、目的基因的获取
二、选择和制备合适的基因载体
三、目的基因与载体的连接
四、重组DNA导入宿主细胞进行扩增
五、重组体的筛选与鉴定
六、克隆基因的表达
一、目的基因的获取
目的基因:生长激素基因(位于染色体17q22-24)
目的基因获取:PCR扩增生长激素基因
PCR技术扩增生长激素基因
二、选择与制备的基因载体
基因载体:质粒
PUC质粒载体
(1) pUC质粒载体的结构
一种典型的pUC系列的质粒载体,包括如下四个组成部分:(i)来自pBR322质粒的复制起点(ori);(ii)氨苄青霉素抗性基因(ampr),但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化,不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点;(iii)大肠杆菌β-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码α-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ′基因;(iv)位于lacZ′基因中的靠近5′-端的一段多克隆位点(MCS)区段,但它并不破坏该基因的功能。
(2)pUC质粒载体的优点
第一,具有更小的分子量和更高的拷贝数如pUC8为2 750bP,pUC18为2686bP。 pUC8质粒平均每个细胞即可达500~700个拷贝。
第二,适用于组织化学方法检测重组体 pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的:acZ′基因,所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此,在应用pUC8质粒为载体的重组实验中,可用Xgal显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定。
第三,具有多克隆位点MCS区段 pUC8质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点MCS区段,它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此,克隆在MCS当中的外源DNΑ片段,可以方便地从pUC8质粒载体转移到M13mp8载体上,进行克隆序列的核着酸测序工作。同时,也正是由于具有MCS序列,可以使具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHI)的外源DNA片段,无需借助其它操作而直接克隆到pUC8质粒载体上。
PUC18/19
三、目的基因与载体的连接
内切酶:(1)核酸内切酶||类酶‖
(2)切割方式:错位切割和垂直切割
CTTCATG TAA
GAAGTACTTAA GGGATT
GGCATCTTAA
GTAG
EcoRI 剪切目的基因
CTTCATG TAA
GAAGTACTTAA GGGATT
GGCATCTTAA
GTAG
目的基因
黏性末端
连接方式:黏性末端连接