文档介绍：蛋白质研究的其他方法(2)
张雪梅
apoe@
医学检验系
基因的功能研究成为热点,研究的对象即为基因编码的产物—蛋白质,生物功能的主要体现者和执行者。
在所有生命活动中,细胞接受外源或是内源的信号,通过其特有的信号途径,调节其基因的表达,以保持其生物学特性,这其中必须涉及蛋白与蛋白、核酸的相互作用。
掌握或发明研究相互作用的方法非常重要。
主要内容
酵母双杂交系统:蛋白—(X)—蛋白
Pulldown:蛋白—蛋白,蛋白—DNA
免疫共沉淀(IP):蛋白—蛋白,蛋白—DNA
电泳迁移实验(EMSA):蛋白—DNA
一、酵母双杂交系统 yeast two-hybrid system
酵母双杂交技术的原理
酵母双杂交系统的组成
酵母双杂交技术的应用
酵母双杂交技术的特点
酵母双杂交技术的改进
其它酵母杂交技术
酵母双杂交系统建立的基础
真核细胞的转录因子:
DNA结合域:
DNA binding domain, BD
转录激活域:
Activation domain, AD
酵母双杂交技术的原理
UAS
LacZ/His
报告基因表达
X
外源基因
BD
GAL4 DNA-BD
外源基因
GAL4 AD
AD
DNA-BD 质粒
AD质粒
表达
表达
融合蛋白
融合蛋白
图酵母双杂交原理图
Y
BD
X
Y
AD
Y
AD
RNA多聚酶
BD
X
First Two-hybrid System
酵母双杂交系统的组成
与BD融合的蛋白表达载体,表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)
与AD融合的蛋白表达载体,表达的蛋白称靶蛋白(prey或target)
带报告基因(report gene)的宿主细胞
酵母双杂交技术的应用
—在活细胞水平检验蛋白间的相互作用;
—分析新基因的生物学功能(筛选鉴定新的蛋白相互作用、筛选鉴定蛋白级联底物、鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响;
—筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响;
—在已知的相互作用中鉴定干扰物质(反向双杂交系统)
例:用酵母双杂交系统筛选与NifA相互作用的蛋白质。科学通报,2005,50(6):540-545
采用的酵母双杂合系统:
酵母细胞:S. cerevisiae PJ69-4A (clontech公司)
含有3个报告基因: ade2、his3和lacZ,其中ade2基因表达最为严谨,his3和lacZ的表达相对松弛。
两个载体pGBD(诱饵)和pGAD(靶蛋白)分别含报告基因trp和leu。