文档介绍：实验三 PCR扩增
姓名:李宗翰专业:环境工程学号:1432999 同组人姓名:刘雪飞
一、实验目的
复****PCR扩增的原理,熟悉PCR的操作流程。
二、实验原理
PCR,即聚合酶链式反应,是一项在体外、短时间内大量扩增特定的DN***段的分子生物学技术。以单链DNA为模板、4种dNTP为底物,在模板3’末端有引物存在的情况下,用酶进行互补链的延伸。多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
PCR包括三个过程:
(1)、变性:目的双链DN***段在94℃下解链;
(2)、退火:两种寡核苷酸引物在适当温度(50~60℃)下与模板上的目的序列通过氢键配对;
(3)、延伸:DNA模板—引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
三、实验仪器及材料
PCR扩增仪,微量移液器(~、~10μL、10~100μL三种),Tip头,,,Taq DNA 聚合酶,dNTP,buffer,引物(341FGC和534r),16S全长DNA样本。
四、实验步骤
1、用微量移液器分别取194μLddH2O、25μL Buffe、10μL dNTP、5μL 341FGC引物、5μL Taq ,,每支管加入24μL混合液。
2、向第1~8支薄壁管分别加入1μL样品模板,第9支管加入1μL无菌水做阴性对照。在薄壁管的盖子上写上组号及样品编号。
3、将9支薄壁管放入PCR扩增仪中,设置好扩增条件:94℃ 3min;94℃ 30s;55℃ 30s;72℃ 30s;72℃ 5min;15℃。循环次数30~40。设置好后启动扩增仪,开始扩增。
4、将扩增的好的样品按下述步骤进行电泳实验:
(1)、 ×TAE于锥形瓶中,放置微波炉中加热2min左右,至混合液透明,取出室温下冷却。将混合液倒入FR-180E制胶器的槽中,插入孔刷,注意不要有气泡。冷却一段时间,等胶凝固。
(2)、取10μL Loading Buffer染液,在铺平的塑料手套上均匀分成9份,再取4μL PCR产物与染液混匀。将10μL移液器调至6-7μL,依次吸取上述混合液滴,分别加入到1-9号胶孔中,第10号胶孔中加入4μL的DL 2000 TM DNA Maeker。
(3)、×TAE的电泳槽中,通100V电压。
(4)、电泳半小时左右,可明显看出染液移动。将胶至于分析仪器内,在紫外灯照射下,得到电泳图并拍照。
五、实验结果与讨论
1、此次实验结果是什么?(请附图)所得到的实验结果该如何解释?
答:此次实验结果如下图所示。
图中,1-8号为待测样品,9号为阴性对照,10号为DNA Marker。
从电泳结果可以看出,3-6号样品对应Marker的250bp左右处有明显的亮带,说