文档介绍：实验十目的基因的遗传转化
一、目的基因的表达载体构建
1. 实验目的
本实验以强化植物基因工程平台技能训练为目的,涵盖PCR分离克隆全长目的基因、Gateway 技术构建目的基因的表达载体、农杆菌介导目的基因的转化、转基因植株的驯化和移栽等系列实验。此外,还就如何利用新型的反向遗传学技术RNAi(RNA interfere,RNA干涉)进行基因功能研究进行试验指导。为从事相关领域的科学研究奠定基础。
通过本实验,要求学生理解和掌握Gateway 技术构建目的基因的表达载体的基本原理和具体实验步骤。
2. 实验原理
Donor载体
ccdB
attP2
attP1
attB2
attB1
PCR产物
Gene
attR2
attR1
副产物
ccdB
BP反应
表达载体
ccdB
attR1
attR2
副产物
ccdB
attP2
attP1
Gene
attL1
attL2
LR反应
表达克隆
Gene
attB12
attB2
Gateway技术构建植物表达载体原理
利用高保真聚合酶,采用PCR方法在克隆基因两侧引入attB重组位点,然后将含有attB位点的PCR产物与含有attp位点和Gateway BP Clonase混合,之后转化E. coli。在两对att位点之间的位点特异性重组过程中产生一个融合载体,融合载体随即分解成两个分子,重组位点在结构上重新分配,目标基因进入新的载体骨架,通过筛选阳性克隆,获得此重组产物,称为“entry克隆”。在得到的entry克隆中目标基因位于att重组位点之间。将此重组产物与选定的Gateway载体和Gateway LR Clonase酶混合,在entry克隆中的attL位点间的序列取代表达(目标)载体的attR位点之间的序列即目标基因进入表达载体,形成表达(目标)克隆(图)。
3. 仪器设备
微量取液器、制冰机、微型离心机、PCR仪、凝胶成像系统、毛细管自动测序仪、电子天平、高速冷冻离心机、振荡器、恒温金属浴、干燥箱、紫外分光光度计、电泳仪、-80 ℃冰箱、-20 ℃冰箱等。
4. 实验试剂
克隆全长基因,pDONRTM221 载体(Invitrogen,12535-019),目标载体(购自
Invitrogen,类型可选)。
(1)核酸和质粒提取试剂,测序试剂,T-vector,DN***段回收试剂盒,Taq聚合酶,反转录试剂盒,DNA marker,氨苄青霉素,X-gal,IPTG等试剂的配方和购买公司见模块一中相应章节。
(2)BP ClonaseTM Enzyme Mix(11789-013)*12、LR ClonaseTM Enzyme Mix*13(11791-019)均购自Invirtrogen公司。
5. 实验方法
克隆含有B序列的目标基因:
(1)设计B序列引物,用于扩增带有B序列接头全长基因。
(2)利用上面第一组引物,进行PCR反应。
(3)以在全长基因上加入一半B序列的扩增产物为模板,进行第二次PCR反应,琼脂糖凝胶电泳检测。
(4)纯化含有B序列PCR产物(磁珠回收纯化法)。
(5)克隆产物与T载体的连接。连接产物的转化。
(6)阳性克隆的筛选及质粒提取。
(7)DNA序列测定。