文档介绍：葡萄基因组DNA提取方法的比较
园艺专业
指导教师
摘要:以葡萄嫩叶为材料提取基因组DNA,为了减少酚类及色素等物质的影响,采用经过改良的SDS法和CTAB法对葡萄叶片进行基因组DNA提取,用琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带,用紫外分光光度计测定其在波长260 nm和280 nm处的吸光值,并根据OD260/OD280的比值分析其DNA的纯度。试验结果表明,
关键词:葡萄;DNA提取;CTAB法; SDS法
parison of Grapes Genomic DNA Extraction Method
Student majoring in horticulture
Tutor
Abstract :In order to reduce the influence of phenolic and pigment and other material, extract DNA from grape leaves for material. Extract genomic DNA of grapes with the modified SDS method and CTAB method , examine the DNA bands with agarose gel electrophoresis, determine the absorbance between the wavelength in 260 and 280 nm with UV spectrophotometer, and analysis the purity of DNA according to the ratio of the OD260 / OD280.
Key words: Grapes; Extracted DNA;CTAB Method; SDS Method
引言
生物遗传信息的载体,是分子生物学的基础。DNA主要集中在细胞核内,线粒体、叶绿体中也含有不少的DNA,在细胞中它以与蛋白质结合的状态存在。1953年Watson和Crick两人提出了DNA分子的双螺旋结构模型,它的提出拉开了分子生物学的序幕,为分子遗传学的发展奠定了基础。维持DNA双螺旋结构稳定的力主要有三种:一种是互补碱基之间的氢键,它在使四种碱基形成特异性的配对上是十分重要的,但并不是维持DNA结构稳定最主要的力,而且氢键的断裂具有协同效应;第二种力是碱基堆积力,是维持DNA稳定的主要力量;第三种力是DNA骨架磷酸残基上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键。DNA在生理pH条件下带有大量的负电荷,要是没有阳离子(或带正电的多聚***、组蛋白等)与它形成离子键,DNA链由于自身不同部位之间排斥力的作用也是不稳定的。原核细胞的DNA常与精***、亚精***结合,真核生物细胞的DNA则在核内与组蛋白结合。
多糖污染是木本植物DNA提取中最常遇到的问题。多糖污染的DNA呈粘稠的胶状,不但给实验操作带来不便,更重要的是多糖对反应体系中的酶活性产生抑制作用,严重影响分子生物学研究的下游工作“。很多多年生木本果树,即使其幼嫩组织多糖的含量也明显高于大田作物[2]。
植物基因组DNA质量检测对所提取的DNA浓度、纯度、构型、相对分子质量的大小等基本情况进行检测分析。有时DNA中含有酚类和多糖类物质会直接影响酶切和PCR的效果。利用DNA分子和蛋白质分子分别在紫外光区波长260nm和280nm处存在最大吸收峰的特性进行分光光度分析,测定DNA样品的纯度。根据A260/A280比值可以估计DNA样品的纯度,纯DNA样品的A260/,,若DNA样品的A260/,说明样品中存在RNA;,说明样品中蛋白质杂质未除尽[3]。
琼脂糖凝胶电泳是检测DNA完整性和分离不同分子量DNA的一种方法。琼脂糖是一种线性多糖聚合物,是从红色海藻产物琼脂中提取出来的。由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖结合的链状多糖。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的点用介质,其密度是由琼脂糖的浓度决定的。琼脂糖的特点是不含核酸酶,电泳速度快,经EB染色后,荧光背景非常低。凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关。琼脂糖凝胶分辨
DN***~50kb之间;若分辨较小相对分子质量的DN***段,则要用聚丙烯酰***凝胶,其分辨范围为1bp~1000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高,孔隙越小,其分辨能力也就越强;反之,浓度越低,孔隙就越大,其分辨能力也就随之减弱。
植物基因组DNA提取方法虽然很多,但每种方法最关键的有3步。第一,破碎细胞壁和细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中;第二,消除蛋白