文档介绍：沉淀分离技术
第三章
§ 蛋白质沉淀方法
§ 核酸沉淀方法
①成本低,不需要特别昂贵的设备
②操作简单、安全
③对许多生物活性物质具有稳定作用
一、中性盐沉淀法(盐析法)
盐析:在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程。
得到的样品欲继续纯化,需花一定时间脱盐。
优点
缺点
盐浓度
Salting-in
溶解度
Salting-out
蛋白质和酶均易溶于水,分子中的-COOH、-NH2和-OH等亲水基团,与极性水分子相互作用形成水化层,包围于蛋白质分子周围形成亲水胶体,削弱了蛋白质分子之间的作用力,蛋白质分子表面极性基团越多,水化层越厚,蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大,因而溶解度也越大。
1、中性盐沉淀蛋白质的基本原理
亲水胶体在水中的稳定因素
电荷
水化膜
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
等点电时的蛋白质(亲水胶体)
带负电荷蛋白质(亲水胶体)
脱水
脱水
脱水
带负电荷蛋白质(疏水胶体)
不稳定蛋白颗粒
阴离子
阳离子
碱
酸
酸
蛋白质聚集沉淀
带正电荷蛋白质(亲水胶体)
碱
+
+
水化膜
带正电荷蛋白质(疏水胶体)
由于中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性,所以加入大量中性盐后,夺走了水分子,破坏了水化膜,暴露出疏水区域。
同时又中和了电荷,破坏了亲水胶体,蛋白质分子即形成沉淀。
选用盐析用盐的几点考虑:
盐析作用要强
盐析用盐需有较大的溶解度
盐析用盐必须是惰性的
来源丰富、经济
2、中性盐的选择
阴离子:
柠檬酸根-3>酒石酸根-3 >F->I03->H2P04->S04->CH3C00->Cl->Cl03->Br->N03->Cl04->I->CNS-
阳离子:
Th4+>Al3+>H+>Ba2+>Sr2+>Ca2+>Cs+>
Rb+>NH4+>K+>Na+>Li+
Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能力进行排序,称Hofmeister序列,或感胶离子序。
常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸钠虽无腐蚀性但低于400C就不易溶解,因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。
0℃
20℃
80℃
100 ℃
(NH4)2SO4

103
Na2SO4

NaH2PO4

101
(1)溶解度大
(2)分离效果好
(3)不易引起变性,有稳定酶与蛋白质结构的作用。
(4)价格便宜,废液不污染环境。
最常用的盐:硫酸铵
缓冲能力弱,具腐蚀性,含N
缺点
优点
(1)加入固体盐法
3、盐析的操作方法
适用:饱和度高,不增大溶液体积
加入硫酸铵固体的量:查表、计算
查表时
注意温度
饱和度:
在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐浓度。