清心解瘀方标准汤剂多指标成分含量测定及UPLC指纹图谱研究.docx

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。清心解瘀方标准汤剂多指标成分含量测定及UPLC指纹图谱研究??李媚,陈盛君,王协和,姜众会,李玲玲,徐以亮,狄留庆,高铸烨,8(,江苏南京210023;,江苏江阴214434;,江苏江阴214434;,江苏江阴214434;,江苏江阴214434;,北京100091;,江苏南京210023;,北京100091)中药汤剂是中药单味饮片或复方在临床应用剂型中使用最广泛、最普遍的形式之一,具有制备简单易行、内服后吸收快、可随证加减等特点。中药标准汤剂是在中医药理论指导下,按照临床汤剂煎煮流程的规范化操作,固液分离,经适当的浓缩方法干燥得到的[1]。近年来,汤剂的研究也得到了重视,杨立伟等[2]提出标准汤剂已成为中药整体质量控制的有效模式之一,认为标准汤剂能作为整体对照物质形式进行中药质量控制,可实现真正意义上的中药整体质量控制。标准汤剂作为衡量中药制剂是否与临床汤剂基本一致的物质基准,可为中药复方制剂生产工艺和药品标准的制订提供依据。标准汤剂内涵丰富,主要涵盖了投料药材的道地性、提取工艺的统一性及质量控制的严谨性。陈士林等[3]认为中药饮片标准汤剂是向中药复方制剂研究和药典收载的中成药品种质量研究和标准制定延伸的重要起点。采用标准汤剂优化而来的生产工艺所生产的制剂最接近临床使用的汤剂物质基础,更加尊重临床用药方式,从而保障了临床疗效。清心解瘀方是由国医大师陈可冀院士治疗心肌梗死的临床经验方愈梗通瘀汤化裁而来,由黄芪、丹参、川芎、广藿香和黄连5味药组成,具有益气化痰、活血解毒的功效,是基于冠心病瘀毒致变病因病机治疗稳定性冠心病的代表方[4]。临床用药为饮片煎汤后服用,对该方药理药效方面已有相关学者进行了研究[5-13],但对其汤剂的物质基准尚未见报道,本研究拟从标准汤剂角度出发,参照标准汤剂制备原则[3]及《医疗机构中药煎药室管理规范》[1]煎煮流程,根据该方入血成分并结合各单味药药效物质基础选择丹酚酸B、阿魏酸、总生物碱和黄芪甲苷作为定量指标,选取道地产区或主产区多批次药材,测定汤剂出膏率、各指标含量及转移率,并建立其UPLC指纹图谱,对指纹图谱共有峰进行聚类分析(CA)、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA),从整体上客观评价汤剂物质基准。(Thermo公司);WatersACQUITYUPLC超高效液相色谱仪(Waters公司);METTLERTOLEDOME204型百万分之一电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司),;KQ-250DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);2L-YMW机械分体煎药壶(潮州市港钿工艺制作厂)。(批号:111562-201716,纯度:%),阿魏酸对照品(批号:110773-201614,纯度:%),盐酸小檗碱对照品(批号:110713-200911,纯度:%),黄芪甲苷对照品(批号:110781-201717,纯度:%),盐酸药根碱对照品(批号:110733-201609,纯度:%),毛蕊异黄***葡萄糖苷对照品(批号:111920-201907,纯度:%),绿原酸对照品(批号:110753-201817,纯度:%),丹参对照药材(批号:120923-201615),广藿香对照药材(批号:121135-201606),黄连对照药材(批号:121752-201801),川芎对照药材(批号:120918-201411),黄芪(蒙古黄芪)对照药材(批号:120974-201612)均购自中国食品药品检定研究院。表小檗碱(批号:5487,纯度≥%),盐酸黄连碱(批号:3784,纯度≥%),芒柄花苷(批号:3818,纯度≥%),木兰花碱(批号:7343,纯度≥%),毛蕊异黄***(批号:6126,纯度≥%),L-色氨酸(批号:6135,纯度≥%),隐绿原酸(批号:3208,纯度≥%),以上对照品均购于上海诗丹德公司。水为超纯水,乙***为色谱纯,十二烷基硫酸钠、磷酸二氢钾、磷酸及其余试剂均为分析纯。18批标准汤剂用黄芪、丹参、川芎、广藿香和黄连均产于各自道地产区或主产区,经江阴天江药业有限公司唐波工程师鉴定均为正品。黄芪药材为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)(Bge.)。。。广藿香药材为唇形科植物广藿香Pogostemoncablin(e)。。18批标准汤剂编号为S1~S18,不同药味批次之间随机组合,配伍药材产地信息见表1。表118批黄芪、丹参、川芎、广藿香、,按照2倍处方量(110g),称取黄芪30g,丹参30g,川芎20g,广藿香20g,黄连10g,除广藿香外的其余4味药置于煎药壶中加入11倍水浸泡30min,先武火煮沸,再文火煎煮,待煎煮25min后加入已先行浸泡的广藿香,武火煮沸后再文火煎煮5min,200目标准筛趁热滤过,药液冷水浴冷却;二煎加入7倍水,武火煮沸后,文火继续煎煮25min,200目标准筛趁热滤过,药液冷水浴冷却,合并药液,减压浓缩(温度60℃,压力-)~,冷冻干燥(温度-40℃,真空度-~-)至粉末状,即得清心解瘀方标准汤剂冻干粉(1g冻干粉相当于3~5g生药量)。、阿魏酸采用WatersACQUITUYUPLCBEHC18(×100mm,)柱;以乙***为流动相A,%磷酸为流动相B,梯度洗脱(0~4min,85%~81%B;4~10min,81%~65%B;10~11min,65%B);检测波长(波长切换法)分别为286nm(丹酚酸B)、321nm(阿魏酸);;柱温为30℃;进样量1μL;理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于10000。在此条件下,供试品溶液中丹酚酸B、阿魏酸分离良好,其他成分无干扰。见图1。;;;;;(×100mm,)柱;乙***-25mmol/L磷酸二氢钾溶液(,)(47∶53)为流动相;检测波长为345nm;;柱温为30℃;进样量1μL;理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。在此条件下,供试品溶液中小檗碱分离良好,其他成分无干扰。见图2。;;;;;;(×100mm,)柱;以乙***-水(32∶68)为流动相;;柱温为30℃;进样量2μL;蒸发光散射检测器,载气流速2L/min,漂移管温度95℃;理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。在此条件下,供试品溶液中黄芪甲苷分离良好,其他成分无干扰。见图3。;;;、,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入80%甲醇25mL,超声处理30min,取出,放冷,再称定质量,用80%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇-盐酸(100∶1)溶液25mL,超声处理30min,取出,放冷,再称定质量,用甲醇-盐酸(100∶1)溶液补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。,精密称定,加入纯水25mL溶解,转移至分液漏斗中,用水饱和正丁醇萃取4次,每次40mL,合并正丁醇液,用氨试液洗涤3次,每次40mL,弃去氨试液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇溶解,定容于10mL容量瓶,滤过,取续滤液,即得。、阿魏酸对照品适量,精密称定,置于25mL容量瓶中,加80%甲醇制成丹酚酸B浓度为70μg/mL,阿魏酸浓度为15μg/mL的混合溶液,即得。取盐酸小檗碱对照品1mg,精密称定,置于25mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释,,即得。取黄芪甲苷对照品适量,精密称定,置于25mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释定容,制成浓度为50μg/mL的溶液,摇匀,即得。、、、、、,记录峰面积。以对照品峰面积为纵坐标(Y),对照品进样量为横坐标(X,μg)绘制标准曲线,丹酚酸B、阿魏酸、盐酸小檗碱、黄芪甲苷线性方程和进样量结果见表2。结果显示,在线性范围内,丹酚酸B、阿魏酸、盐酸小檗碱和黄芪甲苷均线性良好。表2丹酚酸B、阿魏酸、盐酸小檗碱、,盐酸小檗碱、黄芪甲苷对照品溶液,,记录峰面积。结果显示,丹酚酸B、阿魏酸、%、%、%、%,表明各指标分析方法精密度良好。(编号S1),,,于0、1、2、4、6、8、10、12h进样,记录峰面积。结果显示,标准汤剂中丹酚酸B、阿魏酸、%、%、%、%,表明供试品中丹酚酸B、阿魏酸、小檗碱和黄芪甲苷均12h内含量稳定。(编号S1),,平行6份,,记录丹酚酸B、阿魏酸、小檗碱和黄芪甲苷峰面积。结果显示,丹酚酸B、阿魏酸、%、%、%、%,说明各指标方法的重复性良好。(编号S1),精密称定,平行9份,分成3组,依次精密加入丹酚酸B和阿魏酸的混合对照品溶液1、2、3mL(∶1、1∶1、∶1),精密称定,用80%甲醇补足至25mL溶剂质量,、阿魏酸制备方法制备,,计算加样回收率及其RSD,同法测定小檗碱加样回收率。结果显示,丹酚酸B、阿魏酸、%、%、%,%、%、%。取已知含量的标准汤剂冻干粉(编号S1),精密称定,平行6份,分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液2mL(加入比例1∶1),,,计算加样回收率及其RSD。结果显示,%,%。说明各指标回收率均合格。,,,在没有表小檗碱、黄连碱和巴马汀对照品的情况下,对黄连总生物碱的含量测定依据《中国药典》黄连药材表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱相对保留时间的关系[14],确定了标准汤剂小檗碱UPLC图(图2)中后面4个峰依次为表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱,将4个峰峰面积加起来作为总峰面积带入盐酸小檗碱的线性回归方程,求出盐酸小檗碱计总生物碱含量,该方法测定标准汤剂中的总生物碱含量具有快速、简便、节约成本的特点。同时计算标准汤剂中各指标转移率,转移率=W/M×100%,其中,W分别代表标准汤剂中丹酚酸B、阿魏酸、总生物碱和黄芪甲苷含量;M分别代表饮片中丹酚酸B、阿魏酸、总生物碱和黄芪甲苷含量(饮片中各指标含量按照《中国药典》各药味含量测定项下方法测定)。结果见表3。表3标准汤剂中各指标含量测定及转移率结果(%)~S18浓缩液各25g,置于已恒质量的蒸发皿中,水浴蒸干后,于105℃烘箱中干燥至质量恒定,取出,置于干燥器中冷却,称定质量,计算出膏率。出膏率=M取样干浸膏量×M标准汤剂/(M取样×M饮片)×100%,其中,M取样干浸膏量代表取样浓缩液出膏质量,M标准汤剂代表标准汤剂浓缩液质量,M取样代表取样浓缩液质量,M饮片代表标准汤剂饮片质量。结果见表4。,但广藿香油为轻油,川芎油为重油,经测定,,混合油为轻油,故采用轻油提取装置收集挥发油。考虑到汤剂煎煮过程中挥发油部分挥发损失,按照2倍处方量(110g)制备标准汤剂提油时,广藿香与川芎总量仅为40g,收油较困难,故将总处方量放大到250g制备标准汤剂收集挥发油。按照处方比例,称取黄芪68g,丹参68g,川芎45g,广藿香45g,黄连22g,,药液转移至圆底烧瓶中,加挥发油提取装置(轻油装置),回流提取5h,测定标准汤剂中挥发油量。测定结果见表4。含油量=V汤剂中挥发油量/M干浸膏量。其中,M干浸膏量指处方出膏质量,V汤剂中挥发油量指一个处方出膏量中含有的挥发油体积。表4标准汤剂出膏率、(×100mm,)柱;以乙***为流动相A,%磷酸为流动相B,梯度洗脱(0~4min,95%~81%B;4~9min,81%~73%B;9~12min,73%~65%B);检测波长为280nm;;柱温为30℃;进样量为1μL。,精密称定,置于具塞锥形瓶中,加入70%乙醇溶液25mL,超声处理30min,放冷,滤过,取续滤液,即得。,丹酚酸B峰峰形尖锐,峰面积稳定,与各峰分离度高,故选择14号峰(丹酚酸B)作为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。(编号S1)溶液,,以14号峰(丹酚酸B)为参照峰,计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD,同时,运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版),计算各样品UPLC图谱的相似度。结果各特征峰相对保留时间的RSD均<%,。表明仪器精密度良好。