文档介绍：DNA的琼脂糖凝胶电泳分离
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。
与蛋白质分子相似,核酸分子也是两性解离分子,-,碱基几乎不解离,磷酸根全部解离,核酸分子带负电荷,向正极移动。
分子在电场作用下的迁移速度,与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比。不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同,在自由泳动时各核酸分子的迁移率区别很小,难以分开。所以采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,发挥分子筛的功能,使得大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异,达到分离目的,在loading buffer的作用下,可观察电泳的进行情况。
垂板电泳槽转移电泳槽
平板电泳槽双向电泳槽
电泳操作步骤
2、胶床准备
①取出胶床和梳齿,将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内,梳齿底端和床面有一定的间隙
③将胶床放在调整好的水平台上
1、凝胶准备用1×%琼脂糖凝胶。
① g琼脂糖置三角瓶中,加100ml,1×TAE
②微波炉加热大约1-2分钟,熔化琼脂糖
③熔化的琼脂糖自然冷却到60~70℃时(手掌轻触感觉热但是刚能够承受),加入EB,5μl(10 mg/ml),并轻轻混匀
3、铺胶:将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶
床内,凝胶厚度3~5mm(注意在胶床的一个角落倒胶,
同时不能间断,防止倒胶不均或产生气泡;一旦产生气泡,
立即用枪头小心挑出)
4、室温下静置半小时左右,凝胶固化。
将带凝胶的胶床置于电泳槽中,并使样品孔位于电场负极
6、向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液,越
过凝胶表面即可
5、轻轻拔出固定在凝胶中的梳齿。
7、样品准备:手套上向核酸样品中加入6*的上样缓冲液,
用加样器轻轻混匀。样品上10 ul,缓冲液上2 ul。
8、上样:用加样器吸取样品,轻轻的加入到凝
胶的样品孔中。加样量一般小于20 μl
9、盖上电泳槽,接通电源,开始电泳
开始电泳前,再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。
电泳条件:电压120v;,置于碎冰中
10、电泳结束后,切断电源,取出凝胶。
11、电泳结果分析:
①紫外检测仪直接观察电源条带
②摄影记录
Dye :与样品结合并使其显一定的颜色以指示样品在凝胶中所处的位置。
DNA:Ethidium Bromide, EB(溴乙啶)
inlayed into DNA double strands.
10ng
Argent(银试剂) Ag+
very sensitive
溴化乙锭(EB)是一种吖啶类染料,它在紫外灯照射下能发射荧光,当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时,琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物,使DNA发射的荧光增强几十倍,电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。
电泳缓冲液的组成
Tris—乙酸(TAE)
Tris—硼酸(TBE)
Tris—磷酸(TPE)
其浓度约为50mmoL/L,这些缓冲液均含有EDTA。这些缓冲液通常配制成浓缩液,贮存于室温。