文档介绍：实验名称(TitleofExperimetn)蛋白质的定量测定(Folin-酚试剂法)实验日期(DateofExperiment)XXXX实验地点(LabNo.)XXXX合作者(Partner)XXXX指导老师(Instructor)XXXX总分(TotalScore)教师签名(Signature)批改日期(Date)一、。掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及熟悉和掌握实验操作技术。掌握用excel制作标准曲线和通过标准曲线及标准管方法求样品溶液中待测定物质含量。-酚试剂法是经过科学家改进的测定蛋白质含量的方法,Folin首创这种方法:利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基(酚基)还原酚试剂(磷钨酸-磷钼酸)起蓝色反应。而后,Lowry对此法进行了改进,先于标本中加碱性铜试剂,再与酚试剂反应,提高了灵敏度,灵敏度的范围为:,故使得实验的精确度大大提高,但同时也存在着干扰物质多、费时、操作严格计时等问题。在碱性溶液中,双缩脲()能和作用,发生配位反应,形成紫色或紫红色的络合物,即为双缩脲反应。由于蛋白质的肽键结构与双缩脲结构相似,故在碱性溶液中,蛋白质的分子中肽键能和碱性铜试剂中的作用,生成紫红色的蛋白质-复合物。对于蛋白质的测定来说,这一步是基础,这也是Folin-酚法的基础原理。-酚显色反应Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定,其磷钼酸盐-磷钨酸盐易背酚类化合物还原而呈现蓝色。酪氨酸(Tyr)含有酚羟基,故蛋白质-复合物含有的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸,生成蓝色的化合物。在一定的浓度范围内,蓝色的深浅与蛋白质的浓度呈线性关系。故可以利用上述两种反应通过分光光度法测定待测样品的蛋白质含量。本实验以上述两个反应原理为基础,再通过设置空白对照组,标准管中设置蛋白标准液的一系列浓度梯度(,,,)通过分光光度计测定吸光度,从而获取标准曲线,样品管通过测定的吸光度值,在标准曲线中找到较为准确对应的含量。①血清稀释液(正常人血清稀释300倍)①200mg/ml牛血清白蛋白标准液(BSA);②碱性硫酸铜溶液(组成:碱溶液与硫酸铜溶液按50:1混合而成,使用时该溶液必须新鲜配制,当日有效);③Folin-酚试剂(配制过程较为复杂)注:此次实验所用的试剂全部已由老师制备好,所以无配制过程,但需知道配制流程,可查阅实验书P105。①V-1100可见光分光光度计;②恒温水浴箱;③试管6支、试管架;④加样枪、加样枪架。-酚试剂水浴10min比色测定绘图取结果步骤操作(1)反应体系设置取6只洁净的试管,利用加样枪按要求量取相应量的溶液,混合均匀(各试管的需加入的试剂和量见下表):(2)双缩脲反应每隔一分钟,依次往1号试管到6号试管中加入2mL的碱性硫酸铜溶液,摇匀并记录每支试管的加入硫酸铜时间,室温静置10min(3)Folin-酚反应①将静置时间达到10min中的试管中,-酚试剂,快速摇匀(一般在2s以内)。②在40下水浴加热10min钟同样需计时。③10min钟后取出冷却至室温。(4)比色测定①转动波长旋钮,,按“mode”键切换到T档,分别将1-6号试管中混合液放入比色杯中利用1号试管为空白,校置100;②调至A档,依次测定2-6试管的吸光度,并读取数据。③重复操作,再读取数据2次,并记录。数据表格见表1(5)绘制标准曲线利用测得的数据,绘制以值为纵坐标,牛血清清蛋白标准液浓度为横坐标的准备曲线,具体绘制利用excel制作,结果可见图2(6)测样品蛋白质含量根据样品管(6管)的吸光度值,在标准曲线中找到对应的蛋白质浓度,再乘以稀释倍数(300),得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数,即每毫升血清中蛋白质的微克数(mg/ml)。血清蛋白浓度(mg/ml)=样品蛋白质浓度×2×300参考:正常人血清蛋白浓度范围为60~80g/L。①试剂要求:实验所需的试剂必须是新鲜配制,不然会存在被空气及其他物质氧化还原的情况,干扰实验的测定。②控制时间:Lowry反应的显色随时间不断加深,因此各项操作必须精确控制时间。严格按照实验步骤的操作,规定的时间是多少就多少。水浴时间也不宜过长。同时,在最后从水浴加热后取出冷却后,需及时的进行比色测定。防止混合液中物质发生系列变化和反应。③加入Folin-酚试剂后,需要马上混合摇匀,防止磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏。④干扰物质的影响:凡干扰双缩脲反应的基团,均