文档介绍：第三节DNA分子克隆*:指DNA的体外操作,即DNA或基因的限制酶切和连接,进而转化特定的细胞,从而使特定DN***:DNA的限制酶切;DNA连接;转化*:使1)完全酶切SV40(5243bp)pBR322(4363bp)2)),同一DNA分子中不同识别位点的酶切速度可相差10倍(如λDNA中的EcoRI位点)*(反应浓度))纯度:尽可能保持厂家推荐的反应条件ii)稳定性::常用三种核心缓冲液,即高(H),中(M),低(L)盐缓冲液,:大多数为37℃v. 双酶切和多酶切反应同时酶切::i)第一种酶切电泳检查酚/***,),)反应条件*假如两酶切位点相距很近(如多克隆位点区),首先考虑的则是相互间的酶切是否有影响,两种酶切顺序不同时,:pUC18载体:SmaI-BamHI,BamHI-SmaI*GACTCGTCACTCTTTTCGTAGTGAGA GTGCGCGACGGTCGTTAAAGCAAATTTATTGCAGTAAAAAAAGAATACAAAGTA TGTTCGTTACAGCGTTCATTTTCGTGCTGTTT *1).常规作图法测序后直接用计算机程序制作限制酶图谱2)一般作图程序原位DNA样品制备原位DNA限制酶切脉冲场凝胶电泳染色观察3)大尺度作图用酶i. 稀有识别序列内切酶----I型内含子内切酶(真菌细胞核和线粒体基因组,T4噬菌体,衣藻叶绿体和线粒体);酵母HO内切酶;大肠杆菌recA(虽然这些内切酶识别的序列都很长:10-19bp,但高等动植物基因组中含有这类位点却极少,因而很少使用)1)条件i.  电泳方法---脉冲场凝胶电泳ii. 样品制备---原位DNA制备和酶解iii. 人工染色体构建---如pYAC载体构建iv. 脊椎动物基因组中的CpG和植物基因组中的CpXpG序列存在2).大尺度限制酶作图*ii. II型限制酶可用于大尺度限制酶作图的限制酶具有如下特征:识别8或6bp序列;富含或只含GC序列:含有CpG序列i) AscI-和NotI-GCii)  FseI-和SrFI-GGGCiii)  SfiI-iv)  CpoI/CspI/RsrII-CGGA(Gv)  BssHI-GCGCGC,EagI-GCGGvi) NaeI-GCCGGC,NarI-GGCGGC,CGGGvii) MluI-ACGCGT,NruI-TCGCGA,PvuI-CGATCG,SplI-CGTACG*,连接3’-OH和5’-P,依赖于ATP/NAD辅因和Mg2+.1. 连接反应理论当两种DNA分子相连时,它们可能产生不同的结果,这些结果与以下因素有关1) 连接反应系统中的总DNA浓度i2) 一个DNA分子靠近同一分子另一端的有效浓度j,该值与DNA的长度成反比,即DNA分子越大,该分子的两末端越不易相互作用(即自身环化)3) 两种不同DNA分子的摩尔浓度之比值.*1) 评估连接反应结果的方法i. ) 反应条件i.            *