文档介绍：羇蛋白质的一级结构(共价结构)蒅蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。袄蛋白质结构层次莁一级结构(氨基酸顺序、共价结构、主链结构)螈↓是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序芃二级结构羂↓螀超二级结构蒈↓莄构象(高级结构)结构域肁↓艿三级结构(球状结构)芈↓蒆四级结构(多亚基聚集体)。羆拆分蛋白质分子中的多肽链。膃测定多肽链的氨基酸组成。膀断裂链内二硫键。蚀分析多肽链的N末端和C末端。蚆多肽链部分裂解成肽段。膄测定各个肽段的氨基酸顺序薃确定肽段在多肽链中的顺序。肀确定多肽链中二硫键的位置。蒇蛋白质测序的基本策略芆对于一个纯蛋白质,理想方法是从N端直接测至C端,但目前只能测60个N端氨基酸。蚁直接法(测蛋白质的序列)葿两种以上特异性裂解法***NC肃A法裂解A1A2A3A4羄B法裂解B1B2B3B4袈袇用两种不同的裂解方法,产生两组切点不同的肽段,分离纯化每一个肽段,分离测定两个肽段的氨基酸序列,拼接成一条完整的肽链。肅间接法(测核酸序列推断氨基酸序列)膂核酸测序,一次可测600-800bp薂测序前的准备工作蚈蛋白质的纯度鉴定膆纯度要求,97%以上,且均一,纯度鉴定方法。(两种以上才可靠)芀⑴聚丙烯酰***凝胶电泳(PAGE)要求一条带肁⑵DNS—cl(二甲氨基萘磺酰***)法测N端氨基酸莈测定分子量羃用于估算氨基酸残基n=薃蒀方法:凝胶过滤法、沉降系数法膈确定亚基种类及数目肅多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式:螁⑴非共价键结合袀8mol/L尿素,SDSSDS-PAGE测分子量衿⑵二硫键结合肆过甲酸氧化:肃—S—S—+HCOOOH→SO3H荿β巯基乙醇还原:虿袃举例::血红蛋白(α2β2)膂(注意,人的血红蛋白α和β的N端相同。)蝿分子量:M肆拆亚基:M1、M2两条带羅拆二硫键:M1、M2两条带莀分子量关系:M=2M1+2M2膈测定氨基酸组成袆主要是酸水解,同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。,便于选择裂解方法及试剂。蚃①Trp测定袁对二***氨基苯甲醛590nm。薆②Cys测定螃5、5/一二硫代双(—2—硝基苯甲酸)DTNB,412nm螁端基分析芁①N端分析莇DNS-cl法:最常用,黄色荧光,灵敏度极高,DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。袅DNFB法:Sanger试剂,DNP-多肽,酸水解,黄色DNP-氨基酸,有机溶剂(乙酸乙酯)抽提分离,纸层析、薄层层析、液相等膃PITC法:Edman法,逐步切下。无色PTH-氨基酸,有机溶剂抽提,层析。螀②-A-B-C-D-COOH无水肼NH2NH2100℃5-10h。节腿A-NHNH2、B-NHNH2、C-NHNH2、D-COOH袇氨基酸的酰肼,用苯甲醛沉淀,C端在上清中,Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。(Pro不能测)蚄羧肽酶A:除Pro、Arg、:只水解Arg、Lys薈NH2N……………Val—Ser—GlyC螅螂图P118羧肽酶法测C末端羈芈肽链的部分裂解和肽段的分离纯化袆化学裂解法袁①溴化***—Met—X—产率85%蚂②亚碘酰基苯甲酸—Trp—X—产率70-100%聿③NTCB(2-硝基-5-硫***苯甲酸)—X—Cys—蚄④羟***NH2OH—Asn—Gly—芃约150个氨基酸出现一次膁酶法裂解蝿①胰蛋白酶LysX蚅(X≠Pro)莂Arg——X薀芅螇②胰凝乳蛋白酶Tyr——X螄(X≠Pro)羀Trp——X肆薄Phe——X袂荿胃蛋白酶螆Phe(Trp、Try、Leu)——Phe(Trp、Try、Leu)薅羁③Glu蛋白酶Glu——X袈(V8蛋白酶)蒆④Arg蛋白酶Arg——X蚇莃⑤Lys蛋白酶X——Lys芈芇⑥Pro蛋白酶Pro——X蒄肽段的分离纯化蒁①电泳法SDS-PAGE羁根据分子量大小分离羇②离子交换层析法(DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex)蒅根据肽段的电荷特性分离袄③反相HPLC法莁根据肽段的极性分离螈④凝胶过滤芃肽段纯度鉴定羂分离得到的每一个肽段,需分别鉴定纯度,常用DNS-cl法螀要求:SDS-PAGE单带、HPLC单峰、N端单一。(1)耦联芈PITC+H2N—A-B-C-D……pH8—9,40℃PTC——A-B-C-D……蒆蒃(2)裂解虿PTC—A-B-C-D……TFA无水三***乙酸ATZ—A+H2N—B-C-D罿膃(3)转化薁ATZ—APTH—A肈用GC或HPLC测定PTH-A虿PTC肽:苯氨基硫甲酰肽芄ATZ:噻唑啉***苯***(一氨基酸)羄PTH:苯乙内酰硫脲(一氨基酸)螁