文档介绍：分子克隆经验谈做了快一年的分子克隆,犯了很多错误,经历了很多坎坷,也学到了很多东西。分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了,大家抱怨的也最多,我也陷入在个步骤上很久。经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会,在这里跟大家分享一下我的经验,以供和我一样陷入困境及刚开始做克隆的同学参考。关于连接的提问多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。但是我认为,连接不成功,问题并不一定出在连接这步上。有很多环节影响连接的成败,如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。以下我详细说明。1,PCR引物的设计。通俗的不说,需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的***化问题。做普通的克隆会涉及到***化形式有两种:dam***化和dcm***化。常用的大肠杆菌都有这两种***化酶。dam***化酶识别GATC位点并***化;WGG位点(W是A或T)并***化。如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。容易受***化影响的内切酶有:Dpn1(GA/TC)天生就***化;Cla1(ATC/GAT)如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你,dam***化;Xba1(T/CTAGA)如果前面加个GA或后面加个TC也是dam***化,等等有好多。这些容易***化的切点设计引物时一定要注意,避免引入***化位点。如果真是避免不了或者后来才发现问题,那么把***化的质粒转化到***化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有***化,可以切了。***化缺陷型菌有:DM1(Invitrogen)、INV110(invitrogen)、JM110等。2,PCR产物。两种方式:一种纯化后直接酶切连接;一种连T载体再往下切连接。我个人强烈建议第二种,连T载体。因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点:①由于两头把手太短,虽说有保护碱基,但我觉得还是不如从质粒上往下切好切,而且容易切坏、切碎;②无法从电泳上看出来切没切开,因为也就切下了几个十几个bp,带形没啥变化。连T载体的优点:①进载体后,大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的,不用总PCR往出调了,再说PCR那东西还不太稳定,一把多一把少的。②酶切会很清晰,切下来了就是有带,没切动就是没有,没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。连T载体也有些麻烦的地方,如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突,这就要小心鉴别;而且连T载体最好测序看一下PCR的产物对不对、切点对不对。总体来讲连T载体是很有优势的。3,提质粒。有时手工小提或粗提的质粒酶切效果不好,这可能是提取的不够纯或者内切酶品质不好。所以若酶切效果不佳建议用柱子精提或大提。4,酶切。用于连接的酶切很关键。需注意如下几点:①如果是双酶切A和B,预实验中必须做A和B各自的单酶切和A+B的双酶切,好确认这几种酶都好用,质粒上的切点都好用。如果切不开就要考虑是不是酶的问题,buffer的问题,质粒上有没有这些切点,序列是否***化等。②酶切尽量用大体系,如50ul、100ul等。大体系能稀释内切酶包装中的甘油,对反应有利。相反,连接尽量用小体系,以增加DNA末端的碰撞机会。③如果要回收、连接,酶切用的DNA量我的经验是不用太大。大了会切碎,形成一些不规则的末端,不利于连接。④酶切后的电泳,即切胶的那次电泳中,如果切成的条带很清晰,不拖泥带水,没有弥散,没有拖尾,那做回收、连接效果