文档介绍：PCR(多聚酶链式反应)一、实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段,即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下:PCR循环过程中有三种不同的事件发生:(1)模板变性;(2)引物退火;(3)热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。1、变性:加热使模板DNA在高温下(94-95℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。2、退火:在体系温度降至37-65℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,使引物与模板链3’端结合,形成部分双链DNA,即退火阶段。3、延伸:体系反应温度升至中温72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5’到3’方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNATaq聚合酶。二、按下列组份配制PCR反应液TaKaRaLATaq(5U/μl)          μl10×LAPCRBufferII(Mg2+Plus)     5 μldNTPMixture()        8 μl模板DNA(λDNA)*           ng引物 1(10μM)            2 μl引物 2(10μM)            2 μl灭菌蒸馏水            upto 50 μl*【50μlPCR反应体系中模板DNA推荐使用量】 人基因组DNA            ~1μg大肠杆菌基因组DNA         10ng~100ngλDNA                ~5ng质粒DNA              ~10ng三、PCR反应条件。以λDNA为模板,扩增1kbp、35kbp的DNA片段的PCR反应条件如下:【1kbp】95℃   5 ℃  30 ℃  30 sec.    35Cycles72℃   1 ℃  10 min.【35kbp】94℃   5 ℃  10 ℃  15 min.    35Cycles72℃  10 :95℃   5 ℃  45 ℃  45 sec.    35Cycles72℃   2 ℃  10 、可能出现的问题与解决方案:1、假阴性,不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量,④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板:①模板中含有Taq酶抑制剂,②在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。③模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,有可能是模板核酸提取过程出了毛病,可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性