分子克隆实验标准步骤.doc

文档介绍：分子克隆实验标准步骤一、常规分子克隆实验流程:二、分子克隆实验标准步骤(含实验编号):(编号CloneSOP-1)以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo(TOYOBO)为例体系(50ul):10×KODbuf        5uldNTP(2mM) 5ulMg2+                 3ulPrimer1          1ulPrimer2          1ulTemplate50-           upto50ul程序:95℃2min98℃10s58℃30s   35cycle68℃2kb/min68℃7min12℃∞(编号CloneSOP-2)琼脂糖溶液的制备:称取琼脂糖,置于三角瓶中,按1%-%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液,将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。胶板的制备:①取有机玻璃内槽,洗净、晾干;②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上,安好挡板,放好梳子。在距离底板上放置梳子,以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中,使胶液缓慢地展开,直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。④室温下静置30min左右,待凝固完全后,轻轻拔出梳子,在胶板上即形成相互隔开的上样孔。~1×TAE(Tris-乙酸)或TBE(Tris-硼酸)工作液的电泳槽中使用,没过胶面1mm以上。***段(编号CloneSOP-3)以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒(天根)为例使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶上的标签。柱平衡步骤:向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL,12,000rpm(~13,400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中,称取重量。向胶块中加入等倍体积溶液PN(,其体积可视为100μl,则加入100μlPN溶液),60℃水浴放置,其间不断温和地上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块,可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液,直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大,可事先将胶块切成碎块)。注意:对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率;胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱,因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中),室温放置2min,12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CA2放入收集管中。重复操作步骤。将吸附柱CA2放回收集管中,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟,彻底地晾干,以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。将吸附柱